非小細胞肺癌組織中低表達microRNA表達譜*

于筱舟 魏 楓 閆 帆 于文文 任秀寶 李 慧

目前世界范圍內，肺癌是最常見的惡性腫瘤之一和第一位腫瘤致死原因，預后較差［1］。肺癌的發生發展是一系列復雜的，多因素多步驟的過程。因此，尋找與癌癥發生發展相關的基因和分子，對于腫瘤的診斷和治療尤為重要。

microRNA（miRNA）是一類長度約為22個核苷酸的非編碼RNA。自從1993年發現以來，microRNA在細胞功能調控的各方面發揮了巨大的作用［2-3］。成熟的microRNA通常形成RNA誘導的沉默復合體（miR-RISC），在細胞胞漿中和mRNA的3'非翻譯區（3'UTR）互補結合。有時與開放閱讀框架（ORF）和5'非翻譯區（5'UTR）結合，從而抑制翻譯或者使轉錄產物降解［4-5］。此外，一些microRNA可以在細胞核中與沉默復合體一起結合啟動子區域抑制或者激活轉錄［6-7］。

在人類腫瘤當中，很多microRNA發生表達的上調或者下調，表現出促癌或者抑癌的作用［8］。其中，表達降低的相當一部分microRNA已經被證實具有抑癌的作用。因此低表達microRNA表達譜的測定有助于從分子生物學的角度幫助腫瘤的診斷和治療。本研究主要通過芯片的方法初步篩選潛在下調的microRNA，進一步用熒光定量PCR的方法驗證在肺癌中低表達的microRNA表達譜。此外根據腫瘤的分期進行分層分析，初步探索腫瘤患者所處的不同階段與microRNA表達水平的聯系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料獲取 選取2012年7月至2012年8月，47例本院手術患者手術切除標本。其中3例用于芯片檢測，44例用于熒光定量PCR驗證。在47例手術患者中，男性43例，女性4例，中位年齡為61歲，具體臨床病理資料（表1）。所有患者均為初治，之間未接受任何抗腫瘤治療，術后均得到病理證實。手術標本為腫瘤的核心區域和同一患者的正常肺組織區域，經病理觀察，無明顯炎癥、出血和壞死。所有的手術標本在切除后立即存放于液氮保存。所有患者均以簽署知情同意書。本實驗流程符合倫理委員會要求。

1.1.2 試劑 總RNA提取試劑Trizol microRNA芯片Set v3（life technology），MegaplexTMPool，microRNA 逆轉錄試劑盒，universal master mixⅡ，microRNA探針（美國生命科技公司）。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取和質量控制 在液氮中研磨組織，利用Trizol法提取組織總RNA。利用Thermo Biomate 3紫外可見蛋白核酸分析儀測定RNA樣本OD值和濃度。

1.2.2 microRNA芯片檢測和分析 利用MegaplexTMPool逆轉錄生成DNA，程序為16℃，2 min；42℃，1 min；50℃，1 s；85℃，5 min。在7900HT（life technology）型熒光定量PCR儀平臺上運行和分析芯片結果。采用DataAssist（V3.01）軟件進行結果分析。

1.2.3 熒光定量PCR驗證microRNA表達情況 利用microRNA reverse transcription kit逆轉錄試劑盒和microRNA assay特異性引物逆轉錄RNA生成cDNA。反應條件為：16℃，30 min；42℃，30 min；85℃，5 min。之后在7500型熒光定量PCR儀系統上按照標準程序進行PCR。條件為：95℃，10 min；95℃，15 s；60℃，1 min；40個循環。選取U6為內參，利用ΔCT相對定量法測定microRNA表達情況。

1.3 統計學方法

應用SPSS 19.0統計軟件分析，對于microRNA在腫瘤組織與癌旁正常對照的表達水平比較，數據不符合參數檢驗條件，采用配對樣本的非參數秩和檢驗。數據符合參數檢驗的條件，采用對樣本t檢驗。對于microRNA表達水平的分層分析中，采用獨立樣本的非參數秩和檢驗。P＜0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 RNA提取

本實驗采用Trizol法提取組織總RNA。提取后的總RNA用紫外分光光度計定量并且檢測OD值。OD260/280范圍為1.8～2.0。

2.2 microRNA篩選

RT-PCR原理的芯片結果數據利用DataAssist（V3.01）軟件進行分析。發現與正常肺組織相比，有20個microRNA在肺癌組織中顯著下調，分別為hsa-miR-1、 hsa-miR-22、 hsa-miR-27a、hsa-miR-27b、 hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-125b、hsa-miR-142-5p、 hsa-miR-143、hsa-miR-148a、hsa-miR-148b、 hsa-miR-370、 hsa-miR-373、hsa-miR-381、 hsa-miR-489、 hsa-miR-519a、hsa-miR-376c、 hsa-miR-206、 hsa-miR-380-5p、hsa-miR-223-5p、hsa-miR-520c-3p（圖1）。

2.3 microRNA表達水平驗證

在44例癌組織和正常肺成對的標本中，利用實時熒光定量PCR進一步測定芯片篩選出的20種microRNA的含量。其中13種microRNA在癌組織中顯著低表達，分別是hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-143、hsa-miR-519a、 hsa-miR-223-5p、 hsa-miR-1、hsa-miR-520c-3p、 hsa-miR-489、 hsa-miR-27a、hsa-miR-373、 hsa-miR-125b、 hsa-miR-27b、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-206（表2）。

2.4 分層分析腫瘤中低表達的microRNA與腫瘤分期和淋巴結轉移情況的關系

對于13種在腫瘤中顯著低表達的microRNA進行分層分析，有助于探索是否這些microRNA的表達水平和腫瘤患者所處的分期和淋巴結轉移情況有著潛在的關聯。分析結果發現，hsa-miR-125b不僅與腫瘤的分期相關，而且和腫瘤的淋巴結轉移情況也有著顯著的一致性。在早期肺癌患者中和淋巴結未見轉移的患者中，hsa-miR-125b的表達水平較低（表2～4）。

表1 患者臨床病理資料Table1 Clinical data of the patients

圖1 芯片檢測肺癌低表達microRNA表達譜Figure1 Microarray test for low expression profiling of microRNA in non-small cell lung cancer

表2 實時熒光PCR驗證44例手術標本中microRNA表達情況Table2 Real-time RT-PCR verification of microRNA expression in 44 paired tissues

表3 腫瘤中低表達microRNA表達水平和腫瘤分期的關系Table3 Interaction between microRNA expression level and TNM stages

表4 腫瘤中低表達microRNA表達水平和腫瘤淋巴結轉移情況的關系Table4 Interaction between microRNA expression level and lymph node metastasis

3 討論

當前認為microRNA和腫瘤的發生發展，侵襲轉移等方面密切相關。很多實驗研究發現mcioRNA在腫瘤中會發生上調或者下調，而表達量的改變往往伴隨著導致某些功能的改變，這些現象和機制為腫瘤的診斷和治療提供了新方向。其中在腫瘤microRNA的研究中，目前發現表達量增加的microRNA較多，其中很多表達量上調的microRNA具有增加腫瘤的增殖、轉移、免疫耐受、惡性程度及干細胞特性的作用。相比之下，對于下調microRNA的報道相對較少。而低表達的microRNA，很多往往和腫瘤的抑制密切相關。所以對于低表達microRNA表達譜的補充研究，對于腫瘤抑制的機制和腫瘤治療新策略的發現具有重要的意義。

在本研究中確定顯著下調的13種microRNA在其他腫瘤當中也有部分報道，其中microRNA在一些腫瘤當中顯著高表達，如hsa-miR-125a-5p在胃癌、食管癌等腫瘤中可以顯著高表達［9-10］。hsa-miR-125b在多種腫瘤中顯著上調［11］。另外一些microRNA在一些腫瘤中顯著下調，如hsa-miR-206也可以在骨肉瘤中下調［12］。hsa-miR-27b 在 口 腔 腫 瘤 中 顯 著 下 調［13］。hsa-miR-143在胰腺癌、直結腸癌和鼻咽癌等腫瘤中顯著下調，具有抑癌作用［14-16］。hsa-miR-1是當前研究較多的microRNA之一，在多種腫瘤中顯著下調并且具有抑癌作用［17］。有些microRNA在腫瘤中的研究同樣表現出兩面性：如hsa-miR-520c-3p，一方面在纖維肉瘤、乳腺癌中表現出促癌基因的特點［18］；另一方面，在肝細胞癌、前列腺癌中抑制腫瘤生長［19］。hsa-miR-489在口腔鱗癌中顯著上調，發揮促癌作用，甚至可以成為潛在的預后指標［20］，在下咽鱗癌中卻顯著下調［21］，成為一個重要的抑癌microRNA。hsa-miR-27a可以在肝癌等多種癌癥中高表達，發揮促癌的作用［22］，同樣也可以在白血病中下調［23］。hsa-miR-373既可以在肝癌中上調［24］，同樣可以在直結腸癌中下調［25］。hsa-miR-519a可以在肝癌中下調［26］，但是卵巢癌中高表達并且伴隨分期進展而表達量進一步升高［27］。目前對于hsa-miR-223-5p 和hsa-miR-142-5p在腫瘤中的研究報道仍然較少。

通常microRNA的表達水平具有不嚴格的組織，細胞和部位的特異性，也就是說在不同的組織或細胞來源的腫瘤中，同一種腫瘤的瘤組織和外周血標本中，microRNA的表達水平是可以不同甚至相反的。于是，分別對于不同腫瘤和不同類型標本的microRNA表達譜的進行測定，都具有重要意義。尤其非小細胞肺癌的發生和發展與其他腫瘤相比，差異較大，預后又相對不好，因此測定肺癌microRNA的表達譜，對于從分子生物學角度進一步研究非小細胞肺癌有著重要的意義。

我國和亞洲地區的非小細胞肺癌患者的發病情況、病理類型和預后等方面與西方患者有很大區別，如對于靶向藥物的反應性。因此測定我國非小細胞肺癌患者的microRNA表達譜對于疾病治療的探索，尋找預后因素，用藥選擇的研究，有著非常重要的意義。本研究采用芯片技術儲備篩選，之后較大樣本進一步驗證的方法，測定出13種明顯在肺癌中低表達的microRNA，對于microRNA在非小細胞肺癌中的表達下調為前沿報道。此外，初步探索microRNA的表達情況和腫瘤TNM分期和淋巴結分期的關聯，對于今后的機制和治療等方面具有一定意義。

非小細胞肺癌中低表達microRNA表達譜的研究，對于腫瘤診斷的意義和腫瘤耐藥性的關系以及腫瘤治療等方面的研究將是今后工作的重點。

1 Meng J,Xie W,Cao L,et al.shRNA targeting HDGF suppressed cell growth and invasion of squamous cell lung cancer[J].Acta Bioc Biop Sin,2010,42(1):52-57.

2 Lee RC,Feinbaum RL,Ambros V.The C.elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14[J].Cell,1993,75(5):843-854.

3 Vrba L,Jensen TJ,Garbe JC,et al.Role for DNA methylation in the regulation of miR-200c and miR-141 expression in normal and cancer cells[J].PLoS One,2010,5(1):e8697.

4 Iorio MV,Croce CM.MicroRNA dysregulation in cancer:diagnostics,monitoring and therapeutics.A comprehensive review[J].EMBO Mol Med,2012,4(3):143-159.

5 Lee D,Shin C.MicroRNA-target interactions:new insights from genome-wide approaches[J].Ann N Y Acad Sci,2012,1271:118-128.

6 Zardo G,Ciolfi A,Vian L,et al.Transcriptional targeting by microRNA-polycomb complexes:a novel route in cell fate determination[J].Cell Cycle,2012,11(19):3543-3549.

7 Toscano-Garibay JD,Aquino-Jarquin G.Regulation exerted by miRNAs in the promoter and UTR sequences:MDR1/P-gp expression as a particular case[J].DNA Cell Biol,2012,31(8):1358-1364.

8 Guo X,Chen Y,Xu Z,et al.Prognostic significance of VEGF-C expression in correlation with COX-2,lymphatic microvessel density,and clinicopathologic characteristics in human non-small cell lung cancer[J].Acta Bioc Biop Sin,2009,41(3):217-222.

9 Wu WY,Xue XY,Chen ZJ,et al.Potentially predictive microRNAs of gastric cancer with metastasis to lymph node[J].World J Gastroenterol,2011,17(31):3645-3651.

10 Zhao BS,Liu SG,Wang TY,et al.Screening of microRNA in patients with esophageal cancer at same tumor node metastasis stage with different prognoses[J].Asian Pac J Cancer Prev,2013,14(1):139-143.

11 Wu N,Lin X,Zhao X,et al.MiR-125b acts as an oncogene in glioblastoma cellsand inhibitscellapoptosisthrough p53 and p38MAPK-independent pathways[J].Br J Cancer,2013,109(11):2853-2863.

12 Namlos HM,Meza-Zepeda LA,Baroy T,et al.Modulation of the osteosarcoma expression phenotype by microRNAs[J].PLoS One,2012,7(10):e48086.

13 Lo WY,Wang HJ,Chiu CW,et al.miR-27b-regulated TCTP as a novel plasma biomarker for oral cancer:from quantitative proteomics to post-transcriptional study[J].J Proteomics,2012,77:154-166.

14 Tavano F,di Mola FF,Piepoli A,et al.Changes in miR-143 and miR-21 expression and clinicopathological correlations in pancreatic cancers[J].Pancreas,2012,41(8):1280-1284.

15 Zhang JX,Song W,Chen ZH,et al.Prognostic and predictive value of a microRNA signature in stage II colon cancer:a microRNA expression analysis[J].Lancet Oncol,2013,14(13):1295-1306.

16 Chen HC,Chen GH,Chen YH,et al.MicroRNA deregulation and pathway alterations in nasopharyngeal carcinoma[J].Br J Cancer,2009,100(6):1002-1011.

17 Nohata N,Hanazawa T,Enokida H,et al.microRNA-1/133a and microRNA-206/133b clusters:dysregulation and functional roles in human cancers[J].Oncotarget,2012,3(1):9-21.

18 Huang Q,Gumireddy K,Schrier M,et al.The microRNAs miR-373 and miR-520c promote tumour invasion and metastasis[J].Nat Cell Biol,2008,10(2):202-210.

19 Miao HL,Lei CJ,Qiu ZD,et al.MicroRNA-520c-3p inhibits hepatocellular carcinoma cell proliferation and invasion through induction of cell apoptosis by targeting glypican-3[J].Hepatol Res,2013.[Epub ahead of print].

20 Scapoli L,Palmieri A,Lo Muzio L,et al.MicroRNA expression profiling of oral carcinoma identifies new markers of tumor progression[J].Int J Immunopathol Pharmacol,2010,23(4):1229-1234.

21 Kikkawa N,Hanazawa T,Fujimura L,et al.miR-489 is a tumour-suppressive miRNA target PTPN11 in hypopharyngeal squamous cell carcinoma(HSCC)[J].Br J Cancer,2010,103(6):877-884.22 Wu XJ,Li Y,Liu D,et al.miR-27a as an oncogenic microRNA of hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma[J].Asian Pac J Cancer Prev,2013,14(2):885-889.

23 Scheibner KA,Teaboldt B,Hauer MC,et al.MiR-27a functions as a tumor suppressor in acute leukemia by regulating 14-3-3theta[J].PLoS One,2012,7(12):e50895.

24 Wu N,Liu X,Xu X,et al.MicroRNA-373,a new regulator of protein phosphatase 6,functions as an oncogene in hepatocellular carcinoma[J].FEBS J,2011,278(12):2044-2054.

25 Tanaka T,Arai M,Wu S,et al.Epigenetic silencing of microRNA-373 plays an important role in regulating cell proliferation in colon cancer[J].Oncol Rep,2011,26(5):1329-1335.

26 Wang W,Zhao LJ,Tan YX,et al.Identification of deregulated miRNAs and their targets in hepatitis B virus-associated hepatocellular carcinoma[J].World J Gastroenterol,2012,18(38):5442-5453.

27 Kim TH,Kim YK,Kwon Y,et al.Deregulation of miR-519a,153,and 485-5p and its clinicopathological relevance in ovarian epithelial tumours[J].Histopathology,2010,57(5):734-743.