人腦膠質瘤中miR-106b～25基因簇表達的研究*

葉敏華 張安玲 王 坤 吳淼經 黃 強 祝新根

miRNA是繼小干涉RNA（small interfering RNA，siRNA）之后發現的一種穩定的大小為20～25個核苷酸的非編碼小RNA，參與細胞的凋亡、增殖、分化、發育和代謝等生理過程。以往的研究報道，miR-106b～25基因簇成員miR-106b、miR-93、miR-25在多種腫瘤中表達異常［1-6］。故推測miR-106b～25家族可能與膠質瘤形成關系密切。本文采用實時定量PCR和原位雜交的方法對膠質瘤細胞系和組織及組織芯片中miR-106b～25基因簇成員miR-106b、miR-93、miR-25的表達情況進行檢測，探討其表達變化與膠質瘤惡性程度的關系和意義。

1 材料與方法

1.1 對象

1.1.1 細胞系 人腦膠質母細胞瘤細胞系TJ899和TJ905為天津市神經病學研究所神經腫瘤室建立并保存；A172，U251，SNB19，LN229，LN308，U87惡性膠質瘤細胞系購自中國科學院上海細胞生物學研究所細胞庫。

1.1.2 臨床膠質瘤標本 取自天津醫科大學總醫院神經外科手術，所有標本均經病理證實，經倫理委員會認可。液氮速凍后保存于-80℃。

1.1.3 組織芯片 組織芯片由陜西超英生物科技有限公司制備。

1.1.4 試劑和儀器 DMEM培養基、胎牛血清及0.25%胰蛋白酶購自美國Hyclone公司；RNA提取和RT-PCR相關試劑：Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；AMV試劑盒購自美國Promega公司；dNTP、RNAsin購自日本Takara公司；RT-PCR檢測試劑盒Hairpin-itTMmiRNAs qPCR Quantitation Kit購自中國上海吉瑪制藥技術有限公司。原位雜交探針購自丹麥Exiqon公司，探針序列見表1；原位雜交試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；DAPI細胞核分析試劑盒購自美國Sigma公司。

表1 miRNA探針序列（5'-地高辛標記）Table1 Probe Sequence of the miRNA（5'-DIG labeled）

1.2 方法

1.2.1 細胞與組織總RNA的提取 培養細胞及取液氮中保存的膠質瘤組織約40 mg用于總RNA提取，具體步驟參考文獻［7］。提取的RNA用Nanodrop儀檢測miRNA的質量和濃度（OD260/OD280為1.7～2.0），-80℃保存備用。

1.2.2 實時定量PCR 按照Hairpin-itTMmiRNAs qPCR Quantitation Ki（t上海吉瑪制藥技術有限公司）的說明進行逆轉錄過程。擴增條件為95℃、10 min；95℃、30 s，62℃、30 s，40次循環。RT-PCR過程使用MJ-Real time PCR儀（美國BioRad公司）完成，使用U6作為內參。Opticon 2軟件計算ΔC（t）值（2-ΔΔCT的計算方法）表示。以tumorsam表示腫瘤標本或細胞系內的表達，Con表示經U6校正后1倍量的目標基因表達。ΔΔCT的具體計算方法如下：

1.2.3 原位雜交 膠質瘤組織石蠟切片60℃烤片過夜；梯度脫蠟水合；每張切片加上含探針的20 μL雜交液（探針濃度為0.03ng/μL）。常規雜交封片，具體步驟參考文獻［7］。熒光倒置顯微鏡DP-70觀察，拍照。

1.3 統計學處理

所用實驗數據分析使用SPSS 11.6統計軟件包，RT-PCR結果采用ANOVA單因素方差分析，原位雜交結果采用χ2檢驗，表達相關性采用Pearson相關分析，按照P＜0.05作為檢驗水準。

2 結果

2.1 膠質瘤細胞系中miR-106b～25的表達

提取8種膠質母細胞瘤細胞系和1份正常腦組織標本，RT-PCR檢測miRNA的表達。結果表明，以正常腦組織為表達量為基準，miR-106b在LN229、U251和TJ905中表達增高，表達量分別為5.568±5.424、4.324±3.166和 1.337±0.472。miR-93在除SNB19和U87外的所有檢測細胞系中表達增高，表達量分別為A172：2.935±2.572；LN229：17.350±7.185；LN308：1.946±1.742；U251：3.600±2.151；TJ899：1.849±0.862；TJ905：4.142±3.139。miR-25在除A172外的所有檢測細胞系中均高表達，表達量分別為LN229：27.895±3.147；LN308：1.763±0.933；U251：5.121±3.834；U87：3.103±4.150；TJ899：1.898±1.723；TJ905：3.823±2.118（圖1）。檢測的細胞系中，僅有U251、LN229和TJ905中3種miRNA同時表達升高。

2.2 新鮮組織中miR-106b～25的表達

收集膠質瘤標本43例，按2007年WHO腦腫瘤分類標準：Ⅰ級3例，Ⅱ級9例，Ⅲ級15例，Ⅳ級16例。其中，男性28例，女性15例，年齡27.00±15.81歲。

所有膠質瘤標本均提取總RNA，逆轉錄后RT-PCR結果顯示，以病理級別Ⅰ級組織的平均表達量基準，隨著腫瘤病理級別的升高，3種miRNA在各組中的平均表達量也逐步升高。其中，miR-106b和miR-93各組間的表達差異具有統計學意義（F=4.479，P=0.018和F=3.493，P=0.040）。而miR-25的表達無顯著性差異（F=2.766，P=0.075，表2）。

2.3 組織芯片中miR-106b～25的表達

組織芯片共80個點，按照2007年WHO腦腫瘤分類標準：Ⅰ級10例，Ⅱ級13例，Ⅲ級34例，Ⅳ級18例，瘤旁組織5例；其中男性52例，女性28例，年齡40.50±16.65歲。

膠質瘤組織芯片中miR-106b～25的原位雜交結果顯示3種miRNA的表達在高級別膠質瘤中的表達量明顯高于低級別腫瘤中的表達量（圖2）。不同級別間的陽性信號強弱分布存在明顯差異，隨著腫瘤級別的增高，強陽性信號比例增加，Spearman等級相關分析表明3種miRNA的信號強度分布均與膠質瘤的WHO病理分級呈正相關，在miR-106b、-93、-25中的相關系數分別為 rs=0.617，P＜0.001；rs=0.438，P＜0.001；rs=0.463，P＜0.001（表3）。

圖1 RT-PCR檢測體外培養細胞系（8種膠質母細胞瘤細胞系，N：正常腦組織標本）中miR-106b、-93、-25的表達量Figure1 Expression of miR-106b,miR-93,and miR-25 in cell lines(including 8 glioblastoma cell lines,determined via real-time PCR

2.4 膠質瘤細胞系中miR-106b、-93、-25表達的相關性分析

全基因組水平非編碼DNA序列研究發現，有相當一部分miRNAs基因在染色體上的分布是非隨機的，它們緊密相鄰，排列成簇。而針對miRNA表達的研究表明，成簇排列的miRNA基因多會構成一個多順反子而共同表達。但是，也有miRNA基因簇的成員盡管位于同一個轉錄體系中，但表達水平卻不一致。而處于不同染色體上的旁系同源miRNA基因簇也存的高度表達一致性的情況，提示同源miRNA基因簇可能共享相同的順式作用元件。本研究對膠質瘤組織標本中3種miRNA的定量表達結果進行相關性分析，發現3種miRNA的表達存在明顯相關性，miR-106b與miR-93和miR-25之間的Pearson相關系數分別為0.796和0.652，而miR-93與miR-25之間的相關系數則為0.722，均達到了統計學顯著性差異的標準（表4）。這些結果均顯示miR-106b～25在膠質瘤細胞系中表達增高，提示其在膠質瘤的發展過程中可能發揮著一定的作用。3種miRNA的定量表達的相關性分析結果表明3種miRNA的表達具有明顯相關性，可能存在協同轉錄。

表2 實時定量PCR檢測膠質瘤標本中miR-106b～25的表達Table1 2 Expression of miR-106b～25 in glioma samples determined via real-time PCR

表4 miR-106b、-93、-25表達的相關性分析Table4 Correlation analysis of miR-106b,miR-93,and miR-25

3 討論

miRNAs是目前為止被研究得最多的ncRNA，它們通過調控mRNA向蛋白的轉化過程而參與轉錄后調節，在多種生物學過程中扮演著重要的角色。事實上，在許多腫瘤中都發現了表達異常的miRNA。目前小樣本腫瘤miRNA表達譜篩選出的異常表達的miRNA在腫瘤診療中顯示出一定程度的作用。如高表達的miR-155與低表達的let-7a-2與肺癌的不良預后相關［1］。而在乳腺癌中，miR-10b、-125b、-145、-21、-155與乳腺癌的激素受體狀況、侵襲和轉移有直接關系［2］。給負荷肝癌的小鼠注射miR-26a的類似物（mimics）可以減小瘤體積［3］。

腫瘤形成發展過程中，miRNA所起的作用已被眾多實驗研究證實。通過對下游蛋白表達的調控，miRNA可以發揮原癌或抑癌基因的作用。而腫瘤中異常表達的miRNA還可以作為腫瘤診斷及預后判斷的生物標記物，甚至于治療的靶點［4-6］。

miR-106b～25基因簇染色體定位于7q22.1，由miR-106b、miR-93及 miR-25 3個成員組成，與miR-17～92a-1以及 miR-106a～363為旁系同源物。其3個組成成員分別與另外2個基因簇的對應的成員有著完全相同的“種子序列”：miR-106b與miR-93本身種子序列就完全一致，對應的miR-17、-20a、-20b與它們的種子序列也完全一樣，而miR-25則與miR-92a-1、-92a-2、-363為旁系同源，而缺少了另2個基因簇中所含miR-18家族的對應成員。miR-17～92基因簇是第一個被確認的原癌性miRNA［8］，miR-106b～25因與其是同源物而引起我們的關注。以往的研究報道，miR-106b～25基因簇的成員在多種腫瘤中都可以觀察到不同程度的異常高表達［9-14］，而抑制miR-106b～25的3個成員可以抑制肝癌細胞的周期進展，G1期細胞比例增加［15］，提高miR-106b～25的表達則可以促進BE食管細胞和肺成纖維細胞的增殖速率［16］，表明該簇miRNA同樣在腫瘤中起著原癌樣的作用。在本研究中采用實時定量PCR和原位雜交的方法分別檢測了膠質瘤細胞系、新鮮切除的腫瘤標本和膠質瘤組織芯片中該簇miRNA的表達情況，并發現三者在高級別膠質瘤中比低級別腫瘤中的平均表達量高。而針對miRNA與腫瘤級別的相關性分析表明該簇miRNA的表達量與腫瘤的級別呈正相關，顯示出其在膠質瘤的發展過程中可能發揮著一定的作用，需要進一步研究證實。

綜上所述，miR-106b～25基因簇的成員在各級別膠質瘤組織中呈不同程度高表達，可能成為膠質瘤級別分類及預后的生物學標記的候選基因。

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