重組人EGF-IL-18融合蛋白直接競爭ELISA方法的建立

洪德芳，艾冬冬，丁麟超，呂建新，鐘連進，厲保秋，高麗昌，金麗琴

（1.溫州醫科大學 檢驗醫學院、生命科學學院，浙江 溫州 325035；2.山東弘立醫學動物實驗研究有限公司，山東 濟南 250101）

白細胞介素（IL）-18是一種炎癥和免疫增強因子，刺激Th1細胞和NK細胞分泌干擾素γ（IFN-γ），明顯增強Th1免疫反應，具有良好的抑制腫瘤作用[1-2]。然而由于IL-18的效應細胞廣泛分布于人體全身，易引起全身的炎癥反應。表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）在許多惡性腫瘤細胞表面均過度表達，對一些惡性腫瘤細胞的細胞周期、增殖及侵襲等方面起關鍵作用[3-5]。有研究表明，EGFR配體的第三個環狀結構保守基序（C-loop）可特異性與腫瘤細胞表面的EGFR結合但并無活化EGFR的功能[6]。因此，彭穎等[7-9]通過融合EGF受體干擾基序和IL-18成熟肽分子，構建了一種能靶向結合腫瘤細胞的rhEGF-IL-18融合蛋白，并將其在畢赤酵母系統中進行表達。

為了進行rhEGF-IL-18融合蛋白在動物體內的藥代動力學研究，為后續的臨床試驗打下基礎，需要建立一種可靠的血藥濃度檢測方法。為此，本研究選擇了比較具有代表性的食蟹猴進行給藥，針對蛋白類藥物的特點建立了檢測給藥食蟹猴血清中rhEGF-IL-18融合蛋白濃度的直接競爭ELISA方法，并對其進行了方法學評價。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 藥品及抗體：rhEGF-IL-18標準品（1 000 μg/mL）由溫州醫科大學提供；抗rhEGF-IL-18抗體血清由山東弘立醫學動物實驗研究有限公司提供；抗rhEGF-IL-18抗體和酶標抗原委托北京博奧森生物技術有限公司純化制備。

1.1.2 主要儀器及試劑：多功能酶標儀（OLYMPUS）；96孔可拆酶標板（CORNING）；高速低溫離心機（BeckMan）；食蟹猴空白血清（山東弘立醫學動物實驗研究有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 ELISA操作流程：①包被：將稀釋到工作濃度的抗rhEGF-IL-18抗體加入到ELISA板條中，每孔100μL，4 ℃中包被過夜。②封閉：每孔加入200μL的封閉液（0.01 mol PBS 15倍稀釋1.5%干酪素），37 ℃ 2 h后甩干，放4 ℃備用。③加樣：將rhEGF-IL-18稀釋到規定濃度后加入包被板條中（100μL/孔），樣品稀釋液（0.01 mol PBS 30倍稀釋1.5%干酪素）中含有50%的食蟹猴空白血清；關于待測的rhEGF-IL-18樣品：每孔加50μL的樣品稀釋液，再加50μL的待測樣品。將酶標板在37 ℃恒溫箱中放置60 min后，用洗液（含0.05%吐溫的0.01 mol PBS）洗板5次并拍干。④加酶標抗原：將稀釋到工作濃度的酶標抗原（100μL/孔）加在ELISA板孔底部，37 ℃孵育30 min后洗板5次并拍干。⑤顯色：在酶標板每孔中加入100μL TMB顯色液，37 ℃中避光顯色10 min。⑥終止：每孔加入50μL反應終止液（2 mol/L硫酸），終止反應。⑦檢測：以450 nm波長檢測各孔OD值。

1.2.2 包被抗體和酶標抗原工作濃度的確立：用棋盤法確定包被的抗rhEGF-IL-18抗體和酶標抗原最佳工作濃度，分別將包被的抗體稀釋為一系列濃度：0.5、1、2、3、4、5、6、10μg/mL；酶標抗原做1:500、1:1 000、1:2 000、1:3 000、1:4 000和1:5 000稀釋，進行ELISA法測定。同一酶標抗原濃度下，OD450值隨包被抗體倍比而成倍比時的濃度為酶標抗原理想工作濃度，最后選擇OD450值在1.5～2.0時的包被抗體濃度為其理想工作濃度。

1.2.3 標準曲線的繪制：在上述確定的最佳反應條件下，用樣品稀釋液將1 000μg/mL的rhEGFIL-18標準品配制成濃度分別為100、200、300、400、500、600、700、800和900 ng/mL進行ELISA法測定，每個濃度5個樣本。以未加rhEGF-IL-18標準品的孔為陰性孔，測定各孔的OD450。以OD450值為橫坐標，rhEGF-IL-18標準品濃度為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.4 方法學評價：①穩定性：用樣品稀釋液將1 000μg/mL的rhEGF-IL-18標準品配制成濃度分別為200、400、800 ng/mL的溶液，每個濃度5個樣本，分別于室溫下放置1 h，ELISA方法測定樣品濃度，評價短期室溫放置條件下樣品的穩定性；于冰箱-20 ℃貯存24 h取出室溫解凍，按ELISA方法測定樣品濃度，重復一次；于冰箱-20 ℃貯存，于第0、第6、第20天取出室溫解凍，ELISA方法測定樣品濃度，評價凍存穩定性。②精密度和準確性：用樣品稀釋液將1 000μg/mL的rhEGF-IL-18標準品配制成濃度分別為200、400、800 ng/mL的溶液，按照ELISA方法測定樣品濃度，每個濃度5個樣本，連續配制、測定3 d，根據樣品結果計算準確度與精密度。③回收率：食蟹猴空白血清90 L，分別加入2、4和8μg/mL的rhEGF-IL-18溶液10 L，使得空白血清中rhEGF-IL-18的濃度為200、400、800 ng/mL，混勻后，ELISA方法測定每個濃度5個樣本。回收率=樣品濃度/配制濃度×100%。④定量下限：食蟹猴空白血清90 L，加入0.2μg/mL的rhEGF-IL-18溶液10 L，使得空白血清中rhEGF-IL-18的濃度為20 ng/mL，混勻后，ELISA方法測定6個樣本。

1.3 統計學處理方法 采用Excel軟件計算血清藥物濃度個體值、均值（ ±s）、標準差（SD或S）、相對標準差（RSD）和相對偏差（RE）。

2 結果

2.1 包被抗體和酶標抗原工作濃度的選擇 在不同包被抗體濃度下，以酶標抗原稀釋倍數為橫軸、OD450為縱軸繪制反應曲線（見圖1）。從圖中可以看出，當包被抗體濃度為4μg/mL、酶標抗原稀釋倍數為1 000倍時，OD450值隨包被抗體倍比而成倍比，且在1.5～2.0左右。

2.2 標準曲線的繪制 在上述最佳反應條件下，制備ELISA標準曲線（見圖2），并作相關回歸分析，其回歸方程為y=486.74x2-1693.7x+1478.5，R2=0.9898，標準曲線范圍為100～900 ng/mL，反映了本檢測法的可靠性。

圖1 包被抗體和酶標抗原不同工作濃度下的ELISA法檢測

2.3 穩定性評價 每個濃度設置5個重復樣本進行凍融，結果表明rhEGF-IL-18血清樣品室溫放1 h、凍融2次和凍存20 d均較穩定，RSD均明顯小于15%（見表1-3）。

表1 rhEGF-IL-18樣品室溫放置1 h穩定性實驗

表2 rhEGF-IL-18樣品反復凍融2次穩定性實驗

表3 rhEGF-IL-18樣品凍存20 d穩定性實驗

2.4 精密度與準確性評價 每個濃度設置5個重復樣本，連續測定3 d。結果顯示日內精密度及日間精密度變異系數（RSD）均在2.5%以內，準確度（RE）均小于3%（見表4）。

表4 ELISA法測定rhEGF-IL-18準確度與精密度

2.5 回收率評價 每個濃度設置5個重復樣本，回收率=樣品濃度/配制濃度×100%。本法測定rhEGFIL-18在食蟹猴血清中濃度藥物為200 ng/mL、400 ng/mL、800 ng/mL的回收率為95.3%～103.0%（見表5），符合回收率80%～120%的標準。

表5 rhEGF-IL-18在食蟹猴血清中的提取回收率

2.6 定量下限研究 設置6個重復樣本進行研究。本方法的定量下限為20 ng/mL，變異系數（RSD）在5%以內，準確度（RE）小于3%（見表6）。

表6 ELISA法測定EGF-IL-18最低定量下限

3 討論

隨著人們對腫瘤基因及其發展機制的不斷深入研究，針對腫瘤發生發展進程中關鍵分子的特異性治療已逐步取代傳統的細胞毒性藥物篩選成為腫瘤藥物研發中的熱點[10]。由于低毒性和高特異性等優點，分子靶向治療在腫瘤治療中發揮越來越重要的作用[11]。rhEGF-IL-18融合蛋白是一種新型的腫瘤靶向細胞因子，可使效應細胞與腫瘤細胞發生特異性近距離接觸。融合蛋白能與效應細胞表面的IL-18受體和腫瘤細胞表面的EGFR結合，從而起到共價橋聯作用，能更有效地發揮免疫激活作用。rhEGFIL-18融合蛋白不僅能誘導殺傷局部腫瘤細胞，還能通過免疫網絡激活和放大抗腫瘤免疫作用[12]。

目前測定生物體內蛋白多肽藥物的方法主要有免疫分析法、同位素標記示蹤法和生物測定法。相較于其他兩種方法而言，免疫分析法具有經濟、快速和靈敏等優點。ELISA法是免疫分析法中使用最頻繁的，具有操作簡單，不需要無菌操作，檢測結果準確、靈敏、特異性強等優點，現廣泛用于醫學及食品檢驗中。在本研究中，通過rhEGF-IL-18融合蛋白和酶標抗原競爭抗rhEGF-IL-18抗體形成固相復合物，通過顯色后測定OD450得到一條較穩定的標準曲線（R2=0.9898）。經過方法學評價，日內精密度和日間精密度變異系數均小于2.5%；回收率95.3%～103.0%；樣品在室溫放置1 h、凍融2次和凍存20 d三種條件下檢測結果均較穩定；定量下限為20 ng/mL。這些均符合相關指標的要求，表明我們建立的直接競爭ELISA方法重復性好，系統穩定，可用于食蟹猴血清中rhEGF-IL-18融合蛋白的測定，為rhEGF-IL-18融合蛋白的藥代動力學及后續的研究工作奠定了良好的基礎。

[1] Sedimbi SK, H?ggl?f T, Karlsson MC. IL-18 in infl ammatory and autoimmune disease[J]. Cell Mol Life Sci, 2013,70(24): 4795-4808.

[2] Kuppala MB, Syed SB, Bandaru S, et al. Immunotherapeutic approach for better management of cancer-role of IL-18[J].Asian Pac J Cancer P, 2012, 13(11): 5353-5361.

[3] Chung CH, Seeley EH, Roder H, et al. Detection of tumor epidermal growth factor receptor pathway dependence by serum mass spectrometry in cancer patients[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2010, 19(2): 358-365.

[4] Oh MJ, Choi JH, Kim IH, et al. Detection of epidermal growth factor receptor in the serum of patients with cervical carcinoma[J]. Clin Cancer Res, 2000, 6(12): 4760-4763.

[5] Dutta PR, Maity A. Cellular responses to EGFR inhibitors and their relevance to cancer therapy[J]. Cancer Lett, 2007,254(2): 165-177.

[6] Lutsenko SV, Feldman NB, Severin SE. Cytotoxic and antitumor activities of doxorubicin conjugates with the epidermal growth factor and its receptor-binding fragment[J]. J Drug Target, 2002, 10(7): 567-571.

[7] 彭穎, 呂建新. 人EGF受體干擾序列-IL18融合基因構建及其表達產物結構預測[J]. 溫州醫學院學報, 2003, 33(5):289, 291.

[8] Lu JX, Peng Y, Meng ZF, et al. Rational design of an EGF-IL18 fusion protein: implication for developing tumor therapeutics[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2005,334(1): 157-161.

[9] 張歡, 蔡小波, 施曉琴, 等. EGF-IL-18在畢赤酵母中的表達[J]. 溫州醫學院學報, 2010, 40(4): 322-325.

[10] Bild AH, Yao G, Chang JT, et al. Oncogenic pathway signatures in human cancers as a guide to targeted therapies[J].Nature, 2006, 439(7074): 353-357.

[11] Sawyers C. Targeted cancer therapy[J]. Nature, 2004,432(7015): 294-297.

[12] 呂建新, 王震, 何剪太, 等. 靶向IL18-EGF融合蛋白體內抗腫瘤活性研究[J]. 中國現代醫學雜志, 2009, 19(6): 805-810.