植物細胞核分離純化的探討

王祥 殷偉 唐云雯 殷雪 于蕾 岳才軍

摘 要：扼要綜述了植物細胞核的分離制備技術，闡述了實驗環節的關鍵點，分析了制備植物細胞核存在的主要問題，并提出了解決方法。

關鍵詞：植物；細胞核；分離；純化

植物細胞非對稱融合、染色體雜交育種、大片段基因組文庫構建、DNA纖維制備、細胞核中DNA、RNA、蛋白質含量的分析及染色質結構分析等，需要分離純化出較多個體完整，分散較好的細胞核。學者們曾嘗試用不同方法進行植物細胞核的分離，比如大豆、玉米、水稻、煙草、小麥、棉花、長春花、杉木等細胞核的分離或純化近來又有過報道[1-7]，但由于不同植物材料由于結構和組分的不同，所以適合一種植物的細胞核制備方法并不適合于其它植物。本文就一些分離純化植物細胞核的方法進行探討。

對動物細胞核的分離純化已經有了比較好的方案可查，然而對植物細胞卻不盡然。主要是由于植物細胞在結構與內含物等方面顯著不同于動物細胞，植物細胞除了具有細胞壁外，還含有胞間連絲和次生代謝物，這就給細胞核的制備增加了難度。分離純化細胞核需要在材料選擇、預處理、提取液選擇、細胞的破碎方法及純化方法上做綜合考慮。

1 材料選擇

制備植物細胞核一般可以選擇愈傷組織、下胚軸、子葉、懸浮培養細胞和葉片等材料，其中選擇后者居多。然而，愈傷組織和懸浮培養細胞有著自身的優越性。愈傷組織和懸浮培養細胞取材方便，本身就是無菌材料更便于做融合、雜交試驗。離體培養的植物細胞更易于進行同步化處理，且黑暗下培養的細胞基本不含葉綠體，這些都便于核的純化。

2 預處理

處于不同細胞周期的細胞核的大小是不同的，體積可相差幾倍之多，為了便于純化、提高收率，可先將用于制備細胞核的植物材料進行同步化處理。通常可采用低溫（用冰水混合物）培養12h-48h的物理方法；也可采用使用羥基脲、8-羥基喹啉（0.001M-0.004M）或秋水仙素（0.01%-0.5%）的化學方法，處理時間在4h-24h。對于離體培養材料，還可以盡量縮短繼代的周期使得細胞經常處于對數增殖期的辦法使細胞核盡可能均勻一致。對于懸浮培養細胞還應在破碎細胞之前去除漂浮的已自溶的細胞碎片等雜質。

3 細胞破碎方法

主要有研磨法、刀切法、酸解法和酶解法。研磨法提取植物細胞核， 在研磨過程中酚類等物質易氧化， 不可避免的對提取細胞核產生影響， 細胞核提取質量不高。研磨時間長短和力度大小難以掌握，致使很多細胞核被破壞， 產率較低。刀切法，一種是用剪刀將葉片快速剪碎，另一種是用鋒利刀片在放置于冰上的培養皿中于將葉片切碎至盡量細小的勻漿狀。刀切法的操作手法也不容易保持一致，不適用于愈傷組織、懸浮細胞和根莖尖等材料。酸解法一般采用1M-3M鹽酸解離細胞。酸解法效果不穩定。酶解法是利用纖維素酶、果膠酶和/或半纖維素酶等處理細胞。酶濃度在0.5%-2%，纖維素酶濃度高于果膠酶，半纖維素酶有助于純化過程，不添加也可。使用蝸牛酶沒有看到更好的結果。酶解時間為4h-24h。酶解法可以先得到原生質體，再通過擠壓低滲漲破質膜或添加表面活性劑溶膜而釋放細胞核，也可以不收集原生質體，一步實現收獲細胞核，而且不必使用表面活性劑，這時需要延長酶解時間（12h左右）并使材料處于震蕩當中。利用酶解法制備植物細胞核收獲量較大，當然收獲量的大小還與所用的提取液（酶解液）的其它成分密切相關。

4 提取液

可以使用緩沖鹽或非緩沖鹽。緩沖鹽常被選用的包括Tris、MES、HEPES、MOPS和檸檬酸等，濃度在0.015-0.2M，pH7.0-8.0居多，也有使用pH2.0-3.0的。提取液中可選擇添加的成分比較多，比如Mg2+、K+、Na+、精胺、TritonX-100、Tween20、EDTA、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、甘油、PVP、β-巰基乙醇、DTT、PMSF、抗壞血酸等。這些成份能夠穩定核染色質（體）、提供一定的離子強度、維持滲透壓、促進細胞核釋放，移走細胞質，分散葉綠體，減少核粘連、防止細胞核被氧化、減輕酚類等次生物質的干擾，提高細胞核質量。這些成份用量在0.1mM-0.6M，其中糖類物質用量大。

5 分離純化方法

過濾、差速離心和密度梯度離心是最常用的方法。細胞破碎以后通常需要過濾。過濾常利用不銹鋼、尼龍網（120目-400目）和過濾棉等。差速離心需多次反復沉淀和再懸浮，容易使核破裂。沉淀核的離心速度很低即可，如果離心時間過長和速度過高， 雖然會提高核的產量， 但也會增加其他非核材料的沾染。密度梯度溶液多用蔗糖、甘露醇和Percoll。濃度高的蔗糖溶液是非常粘的， 而且這種溶液的粘度受蔗糖含量的增加影響大，濃度高的蔗糖溶液濃度的小的改變對核的沉淀速度會產生很大的影響，所以用蔗糖作梯度離心純化細胞核需格外小心。甘露醇溶液用粘度沒有蔗糖高，但同密度情況下，甘露醇溶液的滲透壓要高于蔗糖溶液的，這也是需要注意的，以免核皺縮。Percoll是較好的介質，只是價格偏高。低速離心（500×g 左右），細胞核集中30%、35%的蔗糖界面較多。

6 存在主要問題及解決措施

植物細胞核提取遇到的主要問題有雜質多、核與內質網等粘連成網、容易破裂。雜質主要來自細胞壁、膜碎片和細胞質成分。過濾可以去除一些雜質，但嚴重降低核的收率，一方面網篩的大小不好選擇，另一方面導致細胞核破裂，特別是使用抽濾。圖1告訴我們植物細胞核膜連著一些網狀的細胞成分，篩孔小了，它過不去，篩孔大了，大的雜質就會多。如果將通過化學的方法將與膜連接的成分盡量去除，發現核又非常容易破損，即使是蓋玻片輕輕的一壓（見圖2）。因此，對于與核膜連接的成分，既要去除，又要不能傷及核膜。減輕核與其它細胞成分粘連方法，可以考慮使用偏酸性的提取液、酶，不建議使用表面活性劑。低速離心甚至靜止片刻（相當于1×g的離心）是較好的初步去除雜質的方法，精細去除雜質則需要進行梯度離心了。對于核容易破裂的問題，可以考慮使用一些膜的保護試劑，特別是在純化的后期，比如葡聚糖硫酸鉀、葡聚糖、蔗聚糖、2-（N-嗎啉）-乙烷磺酸、氯化鈣、磷酸二氫鉀等，同時注意提取純化過程中溶液酸堿度的穩定，離心時盡量不使細胞核沉到離心管底部，而用蔗糖等溶液托住更好。

總之，植物細胞核的提取純化目前還沒有普遍適用的方法，探索適用不同植物、不同材料的核提取純化方法還是需要研究的工作。

參考文獻

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作者簡介：王祥，黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院 2010級生物技術專業本科生。

*通訊作者：岳才軍