基于高通量測序的海濱雀稗轉錄組學研究

賈新平，葉曉青，梁麗建，鄧衍明，孫曉波，佘建明

（江蘇省農業科學院農業生物技術研究所 江蘇省農業生物學重點實驗室，江蘇 南京210014）

海濱雀稗（Paspalumvaginatum，Seashore paspalum）是禾本科（Gramineae）黍族（Paniceae）雀稗屬（Paspalum）的多年生草本植物，原產于美洲，為潮間帶草灘植被的主要組分［1－2］。海濱雀稗是目前耐鹽能力最強的草坪草種，還具有較強的耐澇、耐旱、耐踐踏和耐磨損特性，能在復雜的逆境條件下生長［3－8］。海濱雀稗的葉色翠綠，景觀效果優于狗牙根（Cynodondactylon）、結縷草（Zoysiajaponica）和假儉草（Eremochloaophiuroides）等暖季型禾草，作為草坪草在世界熱帶與亞熱帶地區廣為種植，已成為21世紀最具發展潛力的草坪草種［9］。同時，海濱雀稗還具有良好的適口性和營養價值，可作為優良牧草加以利用［10］。關于海濱雀稗的遺傳多樣性、分子標記輔助育種等研究已有報道［11－12］，但其基因組和轉錄組信息的缺乏，造成海濱雀稗分子標記開發、遺傳圖譜構建、生長發育及其抗逆機理方面的研究相對滯后［13］。

近年來，包括基因組、轉錄組、蛋白質組等各種組學技術在揭示細胞生理活動規律和生物代謝機理的研究中起著越來越重要的作用，而轉錄組學是率先發展起來以及應用最為廣泛的技術［14］。轉錄組（transcriptome）是指細胞在特定狀態下全部表達的RNA的總和，反映相同基因在不同條件下表達水平的差異，并能揭示不同基因的相互作用及各自功能［15］。轉錄組測序能全面快速地獲得某一物種特定細胞或組織在某一狀態下的基因表達情況，用于研究基因結構和功能、可變剪接和新轉錄本預測等［16－20］。相對于傳統的芯片雜交平臺，轉錄組測序無需已知序列設計探針，可對任意物種的整體轉錄活動進行檢測，提供更精確的數字化信號，更高的檢測通量以及更廣泛的檢測范圍。對于許多缺乏基因組信息的物種而言，轉錄組研究已在非模式植物中得到了廣泛應用［21－26］。

盡管海濱雀稗具有很高的經濟價值和生態價值，但其分子生物學研究進展緩慢，基因數據庫資源也十分匱乏。隨著高通量測序技術的迅速發展，極大地促進了植物基因表達研究，這樣不僅可降低測序的成本和時間，而且還可以獲得豐富的數據，有利于植物生長發育及其抗逆等方面的研究［27］。到目前為止，利用新一代高通量測序技術進行草坪種質資源創新與開發的研究還未見報道。本研究首次將Illumina HiSeq 2000高通量測序技術應用到草坪草轉錄組研究中，將測序得到的海量數據進行拼接與組裝，結合生物信息學方法對所獲得的unigene進行基因功能注釋、功能分類、代謝途徑等分析，從功能基因組水平上研究海濱雀稗生長發育過程中重要基因的表達，同時也為進一步的分子標記開發和基因功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1．1 試驗材料

試驗材料為海濱雀稗品種“Adalayd”，由江蘇省農業科學院生物技術所植物細胞工程課題組提供。試驗于2013年8月在江蘇省農業科學院生物技術所溫室中進行，選取長勢良好、健康的植株葉片，迅速將其放入紙帶內，立即經液氮速凍后保存于實驗室超低溫冰箱中備用。

1．2 RNA提取

利用TRIzoL法提取試驗材料海濱雀稗葉片的總RNA。將樣品放入研缽，加適量液氮迅速研磨，轉移到經DEPC處理的2mL離心管中，加入1mL TRIzoL（Invitrogen，CarLsbad－CA92008，USA），旋渦振蕩混勻，室溫靜置10min；4℃、12000r／min離心10min，將上清液移入新的1．5mL離心管，加入等體積的氯仿∶異戊醇（24∶1）混合液，用力搖15s，室溫靜置10min；4℃、12000r／min離心10min，將上清液移至新的1．5mL離心管，加入等體積的異丙醇，室溫靜置10min；4℃、12000r／min離心15min，去除上清液，用RNase－free水配制的75%乙醇洗滌；4℃、12000r／min離心15min，去除上清液；置于冰上自然干燥5min，用RNase－free水溶解，保存于－70℃備用。用AgiLent 2100BioanaLyzer檢測RNA提取質量，RIN值≥7．0。

1．3 轉錄組測序及數據組裝

提取樣品總RNA后，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA。首先加入破碎緩沖液將mRNA打斷成短序列，以這些短序列為模板，用六堿基隨機引物合成第1條cDNA鏈，然后加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第2條cDNA鏈。cDNA經過試劑盒純化并加EB緩沖液洗脫之后做末端修復、加poly（A）并連接測序接頭，然后用瓊脂糖凝膠電泳進行序列大小選擇，最后進行PCR擴增，建好的測序文庫用Illumina HiSeqTM2000進行測序。采用Illumina兩個末端（PE）測序法，最初的原始序列為100bp。原始的測序結果去除制備文庫時產生的接頭序列、兩端低質量序列和低度復雜序列，再利用SOAPdenovo軟件進行序列拼接［26］，之后通過連接兩末端和填補空位，將拼接成的重疊群（Contig），進一步組裝成unigene。轉錄組測序產生的原始序列信息已提交到NCBI的SRA數據庫（SRA BioProject：SRX383837）。

1．4 功能注釋、分類和代謝途徑分析

采用序列比對的方法對unigene進行序列相似性分析，使用BLAST程序將拼接得到的unigene與核酸、蛋白質數據庫進行比對（E值≤1×10－10），選取最佳的功能注釋。核酸數據庫為NCBI的非冗余核酸序列數據庫（non－redundant nucleotide database，Nt），蛋白質數據庫包括 NCBI的非冗余核酸數據庫（non－redundant protein database，Nr）和SwissProt（swissprot protein sequence database）蛋白質序列數據庫。根據 NCBI數據庫的功能注釋信息，使用Blast2GO軟件［27］得到unigene的GO條目，然后用WEGO軟件［28］對所有的unigene進行GO功能分類統計。然后對unigene分別進行蛋白質直系同源數據庫（cluster of orthologous groups，COG）功能分類和京東基因與基金組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）代謝途徑分析。

1．5 SSR位點搜索及分析

對海濱雀稗轉錄組中的unigene序列進行簡單重復序列（simple sequence repeats，SSR）位點搜索，搜索標準為：單、二、三、四、五、六核苷酸基序（motif）至少重復次數分別為10，8，5，4，3，3，對查找的SSR類型進行特征分析。

2 結果與分析

2．1 海濱雀稗轉錄組數據的組裝

采用Illumina HiSeq 2000高通量測序技術對海濱雀稗葉片轉錄組進行了測序，共得到47520544個reads片段，每個reads的長度為100bp，即測序獲得了4752054400bp（4．75Gb）的序列信息。采用SOAPdenovo軟件對reads序列聚類進行拼接，共獲得966165個contig序列。其中，長度50～100bp的contig序列有761498個，占總體的78．82%；100～200bp的contig序列有125173個，占總體的12．96%；而≥200bp的contig序列有79494個，占總體的8．22%（表1）。由此可見，contig序列主要以長度為50～100bp為主，完全符合Illumina測序的預期結果，為后續的數據組裝提供很好的原始數據。

在contig數據的基礎上，進一步對序列進行組裝，共獲得81220個unigene，序列信息達到了87542503bp（87．54Mb），序列大小為201～16328bp，平均長度為1077bp，N50為1680bp。其中，長度200～500bp的unigene有29325個，占總體的36．11%；500～1000bp的unigene有18341個，占總體的22．58%；≥1000bp的unigene有33554個，占總體的41．31%（表2）。

表1 海濱雀稗轉錄組contig數據組裝質量統計Table 1 Data assembly for contig in the transcriptome of P． vaginatum

表2 海濱雀稗轉錄組unigene數據組裝質量統計Table 2 Data assembly for unigene in the transcriptome of P． vaginatum

表3 海濱雀稗unigene的GC含量統計Table 3 Data assembly for GC content of P． vaginatumunigene

GC含量是基因組堿基序列的重要特征之一，能反映基因的結構、功能和進化信息，GC分布不均勻導致基因組不同GC含量序列其性質和功能也有差異。海濱雀稗unigene的GC平均含量為49．98%，其中GC含量40%～60%的unigene（59903個）占總體的73．75%，GC含量20%～40%的unigene（6552個）占總體的8．07%，GC含量60%～80%的unigene（14765個）占總體的18．18%，而GC含量過高（大于80%）或過低（小于20%）的unigene不存在，表明GC含量基本呈正態分布（表3）。

用RPKM方法計算unigene的表達水平，可消除基因長度差異和測序深度的影響［29］。海濱雀稗全部unigene的RPKM平均值為28．68，最大值為50812．5（unigene 42358）。281個unigene的RPKM 值大于500，其中許多基因參與到海濱雀稗的多種生理活動和代謝過程中。91個unigene的RPKM值低于0．2，說明Illumina HiSeq 2000能夠檢測到極低水平的基因表達。

2．2 unigene的功能注釋、分類和代謝途徑分析

2．2．1 unigene的序列相似性分析 使用BLAST程序將組裝得到的unigene與Nr、Nt、SwissProt數據庫進行比對，進行unigene的序列相似性分析。結果表明，38446個unigene在Nr數據庫中可找到相似序列，E值小于1×10－100的unigene有22629個（占總體的58．86%），E值介于1×10－10～1×10－100的unigene有15817個（占總體的41．14%）；相似序列匹配的近緣物種中，高粱（Sorghumbicolor）所占比例最高（45．76%），隨后依次是玉米（Zeamays，38．68%）、水稻（Oryzasativa，8．91%）、小麥（Triticumaestivum，2．45%）和其他物種（4．20%）（圖1）。46169個unigene在Nt數據庫中可找到相似序列，E值小于1×10－100的unigene有28599個（占總體的61．94%），E值介于1×10－10～1×10－100的unigene有17570個（占總體的38．06%）；相似序列匹配的近緣物種中，高粱所占比例最高（62．72%），隨后依次是玉米（25．82%）、水稻（3．81%）、短柄草（Brachypodiumdistachyon，2．11%）和其他物種（5．54%）。24471個unigene在SwissProt數據庫中可找到相似序列，E值小于1×10－100的unigene有8742個（占總體的35．72%），E值介于1×10－10～1×10－100的unigene有15729個（占總體的64．28%）；相似序列匹配的近緣物種中，擬南芥（Arabidopsisthaliana）所占比例最高（46．03%），隨后依次是水稻（20．10%）、玉米（8．30%）、小麥（3．73%）和其他物種（21．84%）（圖1）。由于缺乏海濱雀稗的基因組、EST和蛋白序列信息，部分unigene在數據庫中無法匹配到已知基因。

圖1 海濱雀稗unigene的序列相似性分析Fig．1 Characteristics of homology search of P． vaginatumunigene

2．2．2 unigene的GO分類 基因本體論（gene ontology，GO）是一個國際標準化的基因功能分類數據庫，用于全面地描述不同生物中基因的生物學特征。結合GO數據庫對海濱雀稗的unigene進行功能分類，從宏觀上認識海濱雀稗表達基因的功能分布特征。GO數據庫包括3個相對獨立的本體，分別描述所處的細胞組分（cellular component）、分子功能（molecular function）和參與的生物學過程（biological process）。研究結果表明，可將海濱雀稗unigene劃分為48個功能組，并對每個功能組涉及的unigene進行了統計分析。從圖2中可以看出，51497個unigene歸屬于細胞組分，22718個unigene歸屬于分子功能，60856個unigene歸屬于生物學過程，這一分類結果顯示了海濱雀稗生長過程中基因表達譜的總體情況。其中，“細胞成分”（18763個）、“細胞進程”（17347個）、“代謝進程”（13891個）和“結合活性”（10726個）功能組中涉及的unigene較多，而“翻譯調節活性”（7個）、“金屬伴侶蛋白活性”（4個）、“氮素利用”（2個）和“蛋白標簽”（2個）功能組中涉及的unigene較少。

2．2．3 unigene的COG功能分類 蛋白質直系同源數據庫（cluster of orthologous groups，COG）是對基因產物進行直系同源分類的數據庫。將海濱雀稗unigene與COG數據庫進行比對，預測unigene功能并進行分類統計。研究結果表明，海濱雀稗unigene根據其功能大致可分為25類，并對每類的unigene進行了統計分析（圖3中用A～Z表示）。從圖中可以看出，unigene涉及的COG功能類別比較全面，涉及了大多數的生命活動。其中，一般功能預測類基因最多（4716個）；其次是未知功能類基因（3306個）、翻譯，核糖體結構和生物發生類基因（2662個）、翻譯后修飾，蛋白質折疊和分子伴侶類基因（2247個）和碳水化合物運輸和代謝類基因（2087個）；而胞外結構類基因（11個）和核結構類基因較少（7個）；其他類別的基因表達豐度都各不相同。

圖2 海濱雀稗unigene的GO分類Fig．2 GO functional categories of P． vaginatumunigene

圖3 海濱雀稗unigene的COG功能分類Fig．3 COG function classification of P． vaginatumunigene

2．2．4 unigene的 KEGG分析 KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）是系統分析基因產物在細胞中的代謝途徑以及基因產物功能的數據庫。根據KEGG數據庫的注釋信息能進一步得到unigene的pathway注釋［30］。結合KEGG數據庫，對海濱雀稗的unigene可能參與或涉及的代謝途徑進行了統計分析。研究結果表明，可將海濱雀稗的unigene歸屬于五大類的代謝途徑，主要包括碳水化合物代謝、氨基酸代謝、脂類物質代謝、次生物質代謝、復制與修復、轉錄與翻譯、信號轉導等19類代謝途徑（圖4）。將KEGG pathway數據庫作為參考，可將unigene定位到112個具體的代謝途徑分支。其中，涉及糖異生和糖酵解途徑的基因有140個，占總體的3．35%；磷脂酰肌醇信號系統途徑的基因有133個，占總體的3．18%；甘油磷脂代謝途徑的基因有130個，占總體的3．11%；苯丙氨酸代謝途徑的基因有79個，占總體的1．89%；RNA降解途徑的基因有68個，占總體的1．63%；黃酮類化合物合成途徑的基因有44個，占總體的1．05%；植物與病原物互作的基因有23個，占總體的0．56%（表4）。

圖4 海濱雀稗unigene的KEGG分類Fig．4 KEGG classification of P． vaginatumunigene

2．3 SSR分析

對海濱雀稗的81220個unigene進行SSR位點搜索，共檢測到22721個SSR位點。SSR的類型豐富，單核苷酸至六核苷酸重復類型均存在，所占比例變化較大（表5）。其中，三核苷酸重復所占比例最高，達到了31．71%；比例最低的是二核苷酸重復，僅為4．35%；五核苷酸重復和六核苷酸重復所占比例基本相同，分別為14．15%和14．67%。在檢測到的SSR中，出現頻率最高的10類基序為：A／T（6198個）、CCG／CGG（2992個）、AGC／CTG（1277個）、AGG／CCT（1249個）、AG／CT（776個）、ACG／CGT（516個）、AAG／CTT（415個）、ACC／GGT（376個）、AGAGG／CCTCT（259個）、AGGG／CCCT（197個）。上述SSR特征分析，有助于開展海濱雀稗及其同屬物種的基因組差異分析、通用性標記開發和遺傳圖譜構建的研究。

3 討論

隨著新一代高通量測序技術的廣泛應用，植物基因組研究得到快速發展，但草坪草基因組研究還相對較少。Illumina高通量測序的數據量大、速度快、成本低、效率高［31］，適合于沒有基因組信息的海濱雀稗展開轉錄組測序研究。基于轉錄組學在功能基因組學研究中的重要價值，本研究應用Illumina高通量測序技術對海濱雀稗轉錄組進行測序，研究其基因表達譜和挖掘生長發育過程中的重要表達基因。對海濱雀稗轉錄組進行測序，獲得了

47520544個reads序列；對reads序列進行拼接，共獲得了966165個contig序列。在contig數據的基礎上，序列組裝后得到了81220個unigene，長度大小從201～16328bp，平均長度為1077bp，N50值為1680bp（N50指從組裝最長的unigene依次向下求長度的總加和，當累加長度達到組裝長度的一半時，對應的unigene長度是N50長度。N50值越大，反映組裝得到的長片段越多，組裝效果就越好。測序數據產量和數據組裝質量是轉錄組測序完成情況的重要指標。以上研究結果表明，此次序列組裝的質量和長度可以滿足轉錄組分析的基本要求，且新一代高通量測序技術是批量發現海濱雀稗功能基因的更為有效手段，進一步說明Illumina HiSeq 2000是高通量轉錄組測序的可靠平臺。

表4 海濱雀稗unigene的代謝途徑分析Table 4 Analysis of metabolic pathways of P． vaginatumunigene

續表4 Continued

表5 海濱雀稗SSR不同重復基序分布及優勢堿基組成Table 5 Distribution and compositions of the dominant repeat of the different repeat motifs for SSR

結合生物信息學分析方法，對海濱雀稗unigene與Nr、Nt、SwissProt數據庫進行比對，進行序列相似性和功能注釋分析。46169個unigene與其他近緣生物的已知基因具有不同程度的同源性，并且還獲得了35051個新的unigene（占總體的56．84%），表明在對海濱雀稗基因組及遺傳背景幾乎不清楚的情況下，高通量測序技術是批量發現海濱雀稗功能基因的有效手段。雖然GO是個標準化的生物信息本體數據庫，被廣泛地用于基因的注釋功能，然而由于GO結構設計上的缺陷以及基因的許多特征還未被發現，使得這種基因注釋信息尚不完全。因此，本研究中的海濱雀稗unigene基于GO數據庫進行的相關功能注釋信息還不完善，還有部分的unigene沒有賦予了可能的GO條目，有待通過其他生物信息學方法對unigene功能注釋進一步補充。利用COG數據庫對海濱雀稗unigene進行基因功能分類，可從基因組水平上找尋直系同源體，預測未知ORF的生物學功能，可以大大提高基因功能注釋的準確性。根據KEGG數據庫對上述unigene進行代謝途徑分析，涉及112個具體的代謝途徑分支，參與到海濱雀稗體內的碳水化合物代謝、脂類代謝、次生物質代謝等過程中，為進一步大量挖掘海濱雀稗生長發育過程中的重要表達基因，開展海濱雀稗的基因克隆及功能驗證等研究提供了基礎數據。

SSR分子標記具有操作簡便、重復性好、多態性豐富、遺傳信息量大、共顯性遺傳等優點，已在遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建、功能基因發掘、分子標記輔助育種等研究中得到了廣泛應用［32－36］。采取實驗室手段開發SSR引物費時，耗力，成本高，試驗復雜，基于轉錄組數據庫信息進行SSR分子標記開發將是一種既經濟又有效的方法。目前，海濱雀稗可利用的分子標記數量非常有限，轉錄組產生的海量數據為SSR分子標記的開發提供了更豐富和極有價值的可利用資源。本研究通過查找發現了22721個SSR位點，SSR不但出現頻率高，而且類型豐富。利用在線引物設計軟件共設計出8758對SSR引物，進一步可對這些SSR引物進行擴增檢測，篩選出擴增穩定、條帶清晰、多態性好的引物，為進一步開發新的SSR標記奠定了基礎。SSR分子標記的開發可用于草坪草功能基因的挖掘、豐富分子標記類型、遺傳資源評價、重要性狀的輔助選擇等研究，有助于促進草坪草遺傳育種的發展［37－38］。

本研究首次在國內外采用Illumina HiSeq 2000高通量測序技術建立了海濱雀稗轉錄組數據庫，獲得了大量的轉錄本信息，并對表達基因進行了序列組裝、功能注釋、代謝途徑等分析，為今后更深入研究海濱雀稗功能基因組、基因克隆及抗逆機理研究提供了極大的方便，而且該轉錄組數據還可以作為今后海濱雀稗基因組的參考序列，為海濱雀稗的分子生物學研究提供寶貴的基因組數據來源。

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