利用表型數據構建狗牙根初級核心種質

鄭軼琦，郭琰，房淑娟，徐亞楠，陳靜波，劉建秀

（1．河南科技大學林學院，河南 洛陽471003；2．江蘇省中科院植物所，江蘇 南京210014）

植物種質資源在植物遺傳改良及生產發展中起著非常重要的作用，植物種質資源的收集和保存工作已經得到世界各國政府和科學家的廣泛重視。隨著收集、保存的種質資源數量的急劇增加，如何有效地對種質資源進行保存、更新和評價，高效發掘優異基因并進行利用，從而提高現有資源的利用率是種質資源管理者和育種工作者急需解決的科學問題。核心種質［1－2］的提出為解決這一問題提供了新的思路，并已在很多植物資源中得到廣泛應用。它能以最小的資源數量和遺傳重復性，最大程度地代表整個遺傳資源的多樣性，從而便于種質的保存、評價和利用。目前該研究多集中于農作物及園藝作物［3－10］，牧草和草坪草的研究相對較少。在牧草核心種質構建方面，目前已構建了多年生黑麥草（Loliumperenne）［11］、紫花苜蓿（Medicagosativa）［12］、一年生苜蓿（annualMedicago）［13］、牧草型狗牙根（Cynodonsp．）［14］等的核心種質。

狗牙根（Cynodondactylon）隸屬于禾本科（Poaceae）狗牙根屬（Cynodon），是世界三大暖季型草坪草之一。狗牙根是世界廣布型草種，廣泛分布于北緯53°至南緯45°的廣大地區［15］。在我國，狗牙根主要分布于黃河流域及其以南各地，華北、新疆等地也有分布。國內外學者在狗牙根種質資源的收集、多樣性評價等方面已取得較大的進展。目前國內外學者已經從形態特征［16－24］和分子水平［25－36］對狗牙根的遺傳變異進行了相關研究，這些研究為狗牙根種源的遺傳多樣性系統評價和核心種質的構建奠定了良好的基礎。

江蘇省中科院植物所草坪組近年來收集了大量的狗牙根種源，目前已對所搜集的代表性資源在外部性狀變異、物候期、形態類型、結實性、抗逆性、細胞學以及遺傳多樣性等諸多方面進行了廣泛研究，豐富的種質資源為狗牙根的系統研究和遺傳育種工作提供了大量的材料，然而，如此眾多的資源給保存、評價、鑒定及利用帶來了困難，如何更快、更有效地研究、利用現有的種質資源，對于加快發掘優異的資源為育種服務顯得尤為重要。因此，進行狗牙根核心種質構建研究，對于種質資源創新和有效保護利用以及品種改良、新品種選育等具有十分重要的意義和應用前景。

1 材料與方法

1．1 試驗材料

試驗材料為保存于江蘇省中科院植物所草坪組種質資源圃的831份狗牙根種質資源。其中絕大多數為我國野生資源，分別來自福建（22份）、江西（6份）、上海（4份）、江蘇（95份）、浙江（13份）、山東（18份）、安徽（32份）、湖南（71份）、湖北（41份）、河南（62份）、海南（57份）、廣東（70份）、廣西（52份）、貴州（11份）、四川（15份）、重慶（10份）、西藏（3份）、云南（27份）、陜西（5份）、新疆（12份）、甘肅（7份）、河北（10份）、北京（2份）、天津（1份）、臺灣（1份）、國外引進（53份，包括美國47份，法國5份，卡塔爾1份）、輻射誘變材料（117份）、雜交后代（14份）。

1．2 性狀測定方法

本試驗從2011年6月至2012年6月進行，共測定15個性狀，其中數量性狀11個，質量性狀4個。數量性狀測定項目主要包括匍匐莖節間長度與直徑、直立莖葉片長度與寬度、草層高度、生殖枝高度、穂長度、穗枝數、小穗長度與寬度、小穗數等11個性狀，重復10次求平均。質量性狀測定項目主要包括葉色、匍匐莖色、葉腹面毛及葉背面毛。具體測定方法參見劉建秀等［20］的報道。數量性狀依均值（珡X）和標準差（σ）分為10級，1級Xi＜珡X－2σ，10級Xi＞珡X＋2σ，中間每級差0．5σ。

1．3 初級核心種質構建方法

以國家、省（直轄市、自治區）為單位分組，雜交后代和輻射誘變材料各自成一組，共計30組，在分組基礎上，利用上述15個性狀數據進行聚類分析，聚類方法采用類平均法，種源間遺傳距離采用歐氏距離。從組內取樣比例、總體取樣規模和組內抽樣方法3個方面篩選出構建初級核心種質的最佳策略。其中組內取樣比例包括簡單比例（P）、對數比例（L）、平方根比例（S）和多樣性比例（G），具體計算公式［5－6］如下：

式中，Xi為第i組的樣品份數，Hi為第i組的多樣性指數。

其中多樣性指數的計算方法為：

式中，Hi為各組平均多樣性指數；k為性狀數；l為性狀代碼數；i表示第i個性狀；j表示第j個代碼；Pij為某分組中第i個性狀第j個代碼出現的頻率。

總體取樣規模設5%，10%，15%，20%，25%和30%。組內取樣方法使用隨機取樣和聚類取樣，其中聚類取樣方法根據每一輪聚類圖中最低分類水平上的類（組）內的兩個個體差異最小的一份剔除（組內只有一份材料則直接進入下一輪聚類分析），保留下來的材料再進入一輪聚類、抽樣，直到所取材料樣品量達到設定的要求。上述3個層次共組合成48種取樣策略，為避免主要生物類型的遺漏，每個分組內保證至少有1份樣品入選。

1．4 初級核心種質的代表性檢測

本研究選擇4個核心種質評價參數［7－9］，用于評價核心種質的代表性。分別是：均值差異百分率（mean difference percentage，MD）、方差差異百分率（variance difference percentage，VD）、極差符合率（coincidence rate of range，CR）和變異系數變化率（changeable rate of coefficient of variation，VR），各參數計算公式［9］如下：

式中，St是核心種質與全部種質進行t測驗得到的均值差異顯著（α＝0．05）的性狀數，n是性狀總數。

式中，SF是核心種質與全部種質進行F測驗得到的方差差異顯著（α＝0．05）的性狀數，n是性狀總數。

式中，RC（i）是核心種質第i個性狀的極差，RI（i）是全部種質第i個性狀的極差，n是性狀總數。

式中，CVC（i）是核心種質第i個性狀的變異系數，CVI（i）是全部種質第i個性狀的變異系數，n是性狀總數。在均值差異百分率小于20%，同時極差符合率大于80%的情況下，可以認為該核心種質能夠代表初始種質的遺傳多樣性。并且，均值差異百分率越小，方差差異百分率、極差符合率和變異系數變化率越大，則核心種質越能代表原群體的遺傳多樣性［7］。

1．5 核心種質的確認

為評價所構建的初級核心種質的代表性，利用主成分分析和相關分析法比較初始種質和初級核心種質兩者基于主成分的樣品分布圖及性狀間的相關系數，對構建的初級核心種質進行確認［4，9－10］。應用SPSS 19．0軟件進行相關分析和主成分分析。

2 結果與分析

2．1 狗牙根性狀變異分析

以國家、省（直轄市、自治區）為單位分組，雜交后代和輻射誘變材料各自成一組，共計30組，各組15個性狀的平均值見表1。狗牙根各性狀具有廣泛的變異，不同性狀的變異程度不同，所有性狀的變異系數均大于10%，最高可達100%以上（葉腹面毛和葉背面毛），不同種源性狀間均有較大差異，表明該群體遺傳變異豐富，遺傳多樣性分布范圍較廣，適于進行核心種質構建。

2．2 總體取樣規模的確定

初級核心種質代表性評價參數結果見表2。按照均值差異百分率（MD）小于20%的評價原則，不同的總體取樣規模下，5%，25%和30%的總體取樣規模構建的各核心種質子集的均值差異百分率均不超過20%；10%，15%和20%的總體取樣規模構建的各核心種質中均有超過20%的子集；比較各總體取樣規模的平均均值差異百分率可以看出，25%和30%的平均均值差異百分率最低（10%），其次是5%（11．25%），15%（13．75%），10%和20%最高（15%）。因此通過比較均值差異百分率可以看出，5%，25%和30%的總體取樣規模優于其他水平。按照極差符合率（CR）大于80%的評價原則，15%，20%，25%和30%的總體取樣規模構建的各核心種質的極差符合率均大于80%，且平均極差符合率均大于90%。方差差異百分率（VD）和變異系數變化率（VR）越大，核心種質越能代表原群體的遺傳多樣性，48個核心種質子集中除RG25%和RG30%的變異系數變化率小于100%，其他46個均大于100%，說明每個核心種質均較好地保存了原群體的遺傳變異，通過取樣剔除了原群體中一些冗余的樣品；變異系數變化率在25%的總體取樣規模下整體偏高，平均為72．50%，在所有供試總體取樣規模中最高。綜合比較6種總體取樣規模在保持核心種質各性狀的均值與全部種質的一致性，降低遺傳冗余度，保持性狀的變異范圍和提高變異水平中的作用，認為25%的總體取樣規模是構建狗牙根初級核心種質的最佳總體取樣規模。

2．3 組內取樣比例的確定

從表2可知，4種組內取樣比例構建的各核心種質的均值差異百分率，均有超過20%的子集，但平均均值差異百分率中簡單比例和平方根比例最低（11．67%），低于對數比例（14．17%）和多樣性比例（12．50%）。比較各核心子集的極差符合率可知，4種組內取樣比例的平均極差符合率均大于80%，平方根比例最高（89．26%），12個核心子集中僅1個低于80%，其他組內取樣比例的核心子集中均有2個子集低于80%。簡單比例、平方根比例和對數比例的核心子集的變異系數變化率均大于100%，而多樣性比例的核心子集中，有2個低于100%。平均方差差異百分率在4組內取樣比例構建的核心種質中，以簡單比例最高（70%），其次是對數比例和多樣性比例（均為68．33%），平方根比例最小（66．67%），但總體相差不大。綜合比較各核心子集中的評價參數可知，最佳組內取樣比例為平方根比例。

2．4 組內取樣方法的確定

比較兩種取樣方法可以看出，聚類取樣法構建的核心子集各參數明顯優于隨機取樣，均值差異百分率大于20%的子集全部采用隨機取樣法，極差符合率小于80%的子集也是采用隨機法進行取樣，此外采用聚類取樣法構建的核心種質子集的變異系數變化率和方差差異百分率也普遍高于隨機取樣，所以聚類取樣是構建狗牙根初級核心種質的最佳取樣方法。

綜合以上比較分析發現，在25%的總體取樣規模下，組內采用平方根比例和聚類抽樣方法是構建狗牙根初級核心種質的最適宜方法。

表1 各組狗牙根的性狀平均值Table 1 The average value of bermudagrass traits from different groups

表2 初級核心種質子集的評價參數Table 2 Evaluation parameter of pre－core collection subset %

續表2 Continued

2．5 狗牙根初級核心種質

根據獲得的最佳取樣策略在表型水平建立了包含208份種質的狗牙根初級核心種質，該初級核心種質的具體構成如下：福建7份、江西4份、上海3份、江蘇15份、浙江6份、山東7份、安徽9份、湖南13份、湖北10份、河南12份、海南12份、廣東13份、廣西11份、貴州5份、四川6份、重慶5份、西藏3份、云南8份、陜西3份、新疆5份、甘肅4份、河北5份、北京2份、天津1份、臺灣1份、國外引進15份（包括美國11份，法國3份，卡塔爾1份）、輻射誘變材料17份、雜交后代6份。

2．6 初級核心種質的確認

比較初級核心種質和全部種質的主成分分析發現（表3），兩者具有極為相近的特征值、貢獻率和累計貢獻率。以特征值大于1為標準，各自入選5個主成分，第1個主成分的特征值分別為3．788和4．346，貢獻率分別是25．25%和28．97%，前5個主成分的累積貢獻率分別是69．19%和71．62%，初級核心種質的建立能夠排除冗余，使得累積貢獻率有所提高。

表3 全部種質和核心種質主成分分析的特征值和累積貢獻率Table 3 Eigen value and cumulative contributive percentage for the entire collection and pre－core collection

根據主成分分析結果，利用全部種質和初級核心種質中各株系在第1和第2主成分上的因子得分繪制二維散點圖（圖1）。圖中全部種質的株系集中位于散點分布圖的中部下方位置，并存在較重的相互重疊，表明這些樣品存在較高的遺傳相似性，同時也反映了全部種質的遺傳冗余程度較高。初級核心種質中各株系分布的相互重疊程度得到了較大降低，表明初級核心種質的建立在一定程度上去除了全部種質中的遺傳冗余。此外，從株系的分布格局可以看出，初級核心種質分布的幾何形狀和特征與全部種質非常相似，較多的外圍個體被選入初級核心種質。因此，在25%的總體取樣規模下，采用平方根比例和聚類抽樣方法構建的狗牙根初級核心種質即降低了全部種質的遺傳冗余，同時又確保了核心種質的代表性，很好地保存了全部種質的遺傳多樣性和結構。

在構建核心種質時，合適的取樣策略應考慮相互適應的復雜表型相關性的保持情況［10］。全部種質與初級核心種質性狀間相關分析結果見表4，在狗牙根全部種質中，55對性狀呈極顯著相關，11對性狀呈顯著相關；而在初級核心種質中，呈極顯著相關的性狀為53對，呈顯著相關的性狀為13對，初級核心種質中的性狀間表型相關與全部種質基本一致，表明絕大多數性狀的相關性得到了保持，控制這些相關的相互適應的遺傳復雜性得到了適當并且充分的保持［4］。

圖1 全部種質和初級核心種質的主成分分布圖Fig．1 Principal component plots of entire collection and pre－core collection

3 討論與結論

3．1 總體取樣規模

確定合理的總體取樣規模是構建核心種質的重要環節，過高的取樣規模可能會導致核心種質的遺傳冗余較高，反之則會導致核心種質的代表性下降及重要種質的丟失。目前核心種質構建中沒有固定的總體取樣規模，取樣比例往往隨著原始群體的大小而變化，一般原始群體數量越多，總體取樣規模越小，原始群體數量越少，總體取樣規模越大。Brown［2］提出在樣品數不少于3000份時，以10%的總體取樣規模就可以代表原始群體70%的遺傳多樣性。徐寧等［4］在對中國國家種質庫中保存的4877份小豆（Vignaangularis）種質資源進行了核心種質構建，該核心種質占資源總量的8．92%，涵蓋了98．3%的表型變異。李國強等［6］構建了國家蔬菜種質資源中期庫收集的1651份大白菜（Brassicacampestrisspp．pekinensis）的核心種質，認為15%的總體取樣規模較為合適。劉遵春等［9］對300份新疆野蘋果（Malussieversii）資源進行了核心種質構建，以20%為最適宜的總體取樣規模。徐海明等［37］構建的棉花（Gossypiumbarbadense）核心種質，其原始群體僅168份材料，取樣比例高達30%。本研究通過對48種取樣策略的比較，發現以25%的總體取樣規模構建的核心種質既能保持核心種質各性狀的均值和極差與全部種質的一致性，降低遺傳冗余度，保持性狀的變異范圍和提高變異水平，認為25%的總體取樣規模是構建狗牙根初級核心種質的最佳總體取樣規模。

3．2 組內取樣比例

在進行核心種質構建時，除了要確定合適的總體取樣規模，對分組的種質還要確定合適的組內取樣比例。本研究對4種常用的組內取樣比例（簡單比例、對數比例、平方根比例和多樣性比例）進行了篩選，結果表明平方根比例是構建狗牙根初級核心種質的最佳組內取樣比例。對于不同植物其組內取樣比例的選擇沒有固定的方法，對結果也有著較大的影響。李國強等［6］認為多樣性比例法是構建大白菜核心種質的最佳組內取樣比例。李自超

等［38］在進行云南地方稻（Oryzasativa）種資源核心種質取樣方案研究中對組內取樣比例進行了篩選，認為平方根比例和對數比例較好。余萍等［39］在構建中國普通野生稻初級核心種質研究中發現對數比例法取樣效果最好。齊永文等［40］對甘蔗（Saccharumsinense）細莖野生種核心種質構建策略中的組內取樣比例進行了比較，認為簡單比例法獲得的核心種質代表性最好。不同的組內取樣比例在進行抽樣時都有其各自的優缺點，簡單比例中各組的取樣比例與組內材料數量占整個資源總數的比例一致，對于樣品數量較多而遺傳冗余較大的組別應用這種取樣比例會增加核心種質的遺傳冗余。對數比例和平方根比例中各組的取樣比例分別由各組資源數量的對數值或平方根值占各組對數值或平方根值之和的比例決定，經對數或平方根處理，可以使核心種質中多樣性的偏離得到部分修正。多樣性比例是由組內的多樣性占整個資源多樣性的比例決定的，所以取樣結果也較為可靠。此外不同種質的遺傳結構和多樣性情況各不相同，并且組內取樣比例的確定還要結合取樣策略中其他因子的組合情況，所以在進行核心種質構建中，針對不同的植物種類應該進行組內取樣比例的篩選。

表4 全部種質（上三角）與初級核心種質（下三角）性狀間相關分析Table 4 Correlation among the morphological characteristics in entire collection（above diagonal）and pre－core collection（below diagonal）

3．3 取樣方法

取樣方法決定了全部種質中的株系是否能入選核心種質，所以也是核心種質研究的重點。Frankel和Brown［1］認為，一個好的抽樣方法不僅能最大程度地剔除群體的遺傳冗余，而且能使核心種質的變異和對原群體遺傳多樣性的保有量達到最大化。由于資源的遺傳多樣性分布是不均勻的，因此采用隨機取樣和聚類取樣將會獲得多樣性結構不同的核心種質［41］。Brown［42］曾指出，為獲得種質資源所期望的最基本的遺傳變異，可以考慮使用隨機取樣。Spagnoletti和Qualset［43］也曾在硬粒小麥（Triticumdurum）核心種質的構建過程中提出利用隨機取樣可以獲得整個資源的無偏樣本，但大多數研究均發現聚類取樣的抽樣效果明顯優于隨機取樣［6，38－39，44］。聚類取樣法可以從遺傳距離較近的材料中剔除一定比例的樣本，從而降低了原種質的遺傳冗余并保持原種質的遺傳結構，所以抽樣結果優于隨機取樣。本研究對聚類取樣和隨機取樣構建的核心子集進行了比較，發現聚類取樣是構建狗牙根初級核心種質適宜的取樣方法，進一步印證了聚類取樣的抽樣效果優于隨機取樣。

3．4 主成分分析和相關分析對核心種質的確認

一個代表性好的核心種質必須能最大程度的保存全部種質的株系分布特征以及性狀間的相互關系，因此前人已經采用主成分分析來比較核心種質和全部種質的株系分布特征，用性狀間的相關系數來推斷全部種質中控制性狀間相關性的內在共適應基因系統是否被核心種質很好地保留下來［4，9－10，45－46］。主成分分析可以將第1和第2主成分上的因子得分作為幾何平面的橫坐標和縱坐標，近似地描述樣品在幾何空間的分布特征，個體間距離的遠近反映了它們在遺傳上的相似程度，距離越近的個體相似性越高，反之則越低。因此，基于主成分的樣品分布圖可以近似地反映分析群體的遺傳結構［9］。本研究通過比較初級核心種質和全部種質的主成分分布圖，結果表明初級核心種質中各株系分布的相互重疊程度較全部種質得到了較大降低，表明初級核心種質的建立在一定程度上去除了全部種質中的遺傳冗余，初級核心種質的株系分布特征也與全部種質非常相似。性狀間的相關是物種的一個內在特性，是控制性狀的遺傳物質或生理代謝存在某種關聯的外在表現，抽樣不應改變這種生物固有的性狀間的遺傳相關［9］，本研究通過比較初級核心種質和全部種質的性狀間相互關系，驗證了所構建的狗牙根初級核心種質的代表性。所以通過上述兩種分析方法的驗證，進一步確認了在25%的總體取樣規模下，組內采用平方根比例和聚類抽樣方法是構建狗牙根初級核心種質的最適宜方法。根據獲得的最佳取樣策略最終在表型水平上建立了包含208份種質的狗牙根初級核心種質，該種質可以作為整體資源的代表性樣本，在狗牙根種質資源的充分開發和利用中發揮重要作用。

基于表型數據構建核心種質一直以來都是核心種質構建的重要方法，也是傳統方法，但由于表現型值不能真實反映基因型的差異，且易受外界環境條件的影響，所以基于表型數據得到的核心種質難以代表原有種質資源的遺傳多樣性［47］。使用分子標記的方法，能夠在較短時間內獲得大量的遺傳信息，并且能很好的反映種質資源群體中個體間的親緣關系，但由于分子標記實驗的費用較高，而種質資源的原始群體一般規模龐大，因而很難對每個樣品逐一進行分子標記檢測。因此目前較多采用先利用表型數據構建初級核心種質，再利用分子標記對初級核心種質進行壓縮。所以本研究先利用表型數據將原始群體壓縮，構建初級核心種質，然后采用分子標記數據構建狗牙根的核心種質資源，最終將獲得高質量的核心種質庫。

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