六倍體雜交狼尾草體細胞突變體特異性分析

鐘小仙，劉智微，劉偉國，崔莉莉，吳娟子，張建麗

（江蘇省農業科學院畜牧研究所，江蘇 南京210014）

狼尾草屬（Pennisetum）隸屬于禾本科，全世界約有130個種，廣泛分布于熱帶、亞熱帶和部分溫帶地區，一年生二倍體美洲狼尾草（Pennisetumamericanum；2n＝2x＝14，AA）和多年生四倍體象草（P.purpureum；2n＝4x＝28，AABB）是其中最重要的2個種［1］。美國喬治亞州立大學Tifton試驗站自20世紀40年代開始雜交狼尾草品種選育［2］，利用美洲狼尾草不育系與象草恢復系遠緣雜交獲得了三倍體雜交狼尾草，能綜合母本美洲狼尾草品質優和父本象草產草量高、抗逆性強、可多年生的特性［3－4］。雜交狼尾草不僅可作為草食畜禽的優質青飼料，優質紙漿和人造板原料，還是重要的生物質能源作物［5－8］。但由于父本象草為光周期敏感型短日照作物，自然開花期在美國大部分地區因霜凍危害，無法完成大面積雜交制種或種子產量極低，Tifton試驗站迄今尚未實現商品化種子生產。通過秋水仙素處理進行染色體加倍、結合集團選擇或回交選育能種子繁殖、綜合農藝性狀優良的六倍體或四倍體雜交狼尾草，被認為是一種恢復雜交狼尾草育性和進行商品化種子生產的可能途徑，美國、巴西、印度等國已取得了初步的進展［9－12］。江蘇農業科學院20世紀80年代從美國引進了雜交狼尾草品種及其親本材料，經過多年的系統研究，盡管建立了“人工短日照處理誘導象草開花并與美洲狼尾草不育系花期相遇”制種體系，率先突破了北緯26°以北地區不能雜交制種的生態禁區，但近年來災害性天氣發生頻繁，父母本花期相遇不穩定，制種產量低、風險大［13－14］，亟需嘗試雜交狼尾草大面積商品化種子生產的其他途徑，特別是耐鹽“蘇牧2號”象草2010通過全國牧草品種審定后［15］，創造耐鹽六倍體雜交狼尾草新種質，并與美洲狼尾草雜交選育四倍體耐鹽雜交狼尾草成為近期育種的又一目標。

本文以六倍體雜交狼尾草體細胞突變體CHP2009－14為材料，耐鹽雜交狼尾草（美洲狼尾草Tift23A×蘇牧2號象草）為對照，通過綜合農藝性狀評價和飼用價值比較、葉片微形態特性分析和流式細胞術鑒定，以期明確六倍體耐鹽雜交狼尾草新種質的特異性，為四倍體雜交狼尾草新品種選育提供參考，有關研究國內尚未見報道。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

大田試驗在大豐市金海農場試驗基地進行。試驗地土壤為輕質沙壤，有機質、堿解氮、速效磷含量分別為16.8g/kg，31.2mg/kg，22.35mg/kg，pH 8.1，含鹽量為3.6g/kg。

1.2 試驗材料

雜交狼尾草（CK）：美洲狼尾草不育系Tift23A×蘇牧2號象草，2n＝3x＝21，為三倍體；CHP2009－14：2007年，以對照雜交狼尾草幼穗離體培養獲得的胚性愈傷組織為材料，經500mg/L秋水仙素誘導72h獲得的體細胞突變體，2n＝6x＝42，為六倍體耐鹽雜交狼尾草體細胞突變體。

1.3 試驗方法

1.3.1 體細胞再生植株大田綜合農藝性狀評價和營養品質分析 2011年5月10日，把冬季塑料大棚保存的CHP2009－14和對照雜交狼尾草種莖移栽至大田，畦寬4m，行株距為45cm×40cm，每小區10行，每行8株，小區面積為16m2，隨機區組設計，3次重復。移栽前施無機復合肥（N∶P∶K＝10∶8∶7）750kg/hm2作基肥，苗期追施尿素75kg/hm2。

2011年8月1日，對植株綜合農藝性狀進行定性觀察后，每個小區隨機選取5株測量株高（從地面至植株的最高部位的絕對高度），計算其平均值；每個小區各隨機選取10株，測量主莖倒數第3張完全展開葉的長度和寬度，計算平均值；選取葉片中間區域、主脈左右厚度均勻的部位，打孔器取葉片小樣，用游標卡尺測量20片小樣的中心處厚度，計算其平均值，并測定葉片葉綠素含量［16］；選取中間8行進行刈割測產，刈割留茬高度為15cm，取約1kg樣品莖葉分離后，75℃烘干測定含水量，計算干物質產量，并進行營養品質分析，粗蛋白、酸性洗滌纖維、中性洗滌纖維、粗灰分的測定參照Van Soest纖維測定法［17］，體外干物質消化率（IVDMD）采用Goto胃蛋白酶－纖維素酶兩步消化法測定［18］，刈割后田間統計中間6行植株的平均分蘗數。

1.3.2 葉片表皮微形態結構分析 2011年7月28日，每個小區分別選取2個供試材料各1株，切取其倒數第3張完整葉片的中間區域（長1cm、寬為葉片自然寬度），浸泡在30%過氧化氫∶醋酸（v∶v＝1∶1）溶液中，在60℃烘箱內放置2～4h，待葉肉組織和表皮細胞分離后取出，放入裝有適量蒸餾水的培養皿中，用鑷子分離葉片上、下表皮，1%番紅染色3～6min，制成臨時裝片，在OLYMPUS CX31光學顯微鏡下觀察并拍照。采用形態學（熒光）圖像分析系統1.0軟件（JD801，江蘇捷達軟件工程有限公司，南京）測量如下各項指標。

氣孔器密度：在10×10倍的物鏡下，每份材料選擇30個清晰視野拍照，計數氣孔器數目，測量視野中表皮面積，計算密度。

氣孔器長度、寬度及面積：在10×40倍物鏡下，每份供試材料選取15個視野，每個視野隨機測量2個氣孔器的長度、寬度和面積。由于取樣后氣孔處于關閉的狀態，試驗測得的氣孔器長度和寬度是指氣孔關閉狀態下啞鈴型氣孔器的長度、寬度以及面積［19］。

1.3.3 流式細胞術分析 2011年8月5日，各小區選取供試材料各1株刈割后再生的幼嫩葉片20～30mg，用刀片迅速切碎，放入加有1mL LB01緩沖液（15mmol/L Tris－HCl，2mmol/L Na2EDTA，80mmol/L KCl，20 mmol/L NaCl，0.5mmol/L spermine，15mmol/L mercaptoethanol，0.1%Triton X－100，pH 9.0）的培養皿（培養皿置于冰袋上）中，用移液槍將混合液吸打2～3次，經二層400目（38μm）尼龍網過濾，濾液收集至1.5mL的離心管中，4℃、2000r/min離心3min，棄上清液，加入200μL LB01緩沖液，輕輕振蕩細胞重新懸浮，加入25μL的碘化丙啶（1mg/mL）進行染色，并加入5μL RNase（1mg/mL），4℃、避光染色約1h后，轉入標準上樣管中，采用美國BD公司的FACSCalibur流式細胞儀進行測定，使用隨機軟件Cellquest Pro獲取數據，采用Flowjo 7.5軟件做細胞周期分析。

1.4 數據分析

利用Excel 2003軟件進行數據統計，SPSS 16.0軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 綜合農藝性狀評價和品質分析

與對照三倍體雜交狼尾草相比，六倍體新種質CHP2009－14株型緊湊，葉色深綠，葉綠素含量比對照提高10.51%（P＜0.05），葉片變短變厚，莖節縮短，葉片和葉鞘上絨毛增多，花藥無花粉散出，聯苯胺－過氧化氫反應液能將CHP2009－14的白色柱頭染成深藍色并伴有大量氣泡出現，表明柱頭具有可授性。六倍體雜交狼尾草新種質CHP2009－14的株高與對照三倍體雜交狼尾草相比降低了26.34% （P＜0.01），葉片長度減少了20.06%（P＜0.01），葉片厚度增加了16.41% （P＜0.01），莖葉比減少了43.61% （P＜0.01），分蘗數提高44.62% （P＜0.01），葉片寬度CHP2009－14與對照差異不顯著（表1）。

與對照三倍體雜交狼尾草相比，六倍體雜交狼尾草新種質CHP2009－14體外消化率顯著提高6.94% （P＜0.05），粗蛋白含量和灰分含量分別極顯著提高62.34% （P＜0.01）和17.35% （P＜0.01），中性洗滌纖維含量和酸性洗滌纖維含量分別降低3.35% （P＞0.05）和提高0.50% （P＞0.05），差異不顯著。六倍體雜交狼尾草新種質CHP2009－14的鮮草產量比對照提高0.87% （P＞0.05），但由于六倍體雜交狼尾草新種質植株的含水量低于對照，干物質產量比對照低3.27% （P＞0.05），差異均未達到顯著水平（表2）。

表1 六倍體CHP2009－14與三倍體雜交狼尾草（CK）生物學特性比較Table 1 Comparison of biological characteristics in hexaploid CHP2009－14and triploid hybrid Pennisetum

表2 六倍體新種質CHP2009－14與三倍體對照雜交狼尾草生物產量和品質比較Table 2 Comparison of biomass and animal nutrition in hexaploid CHP2009－14and triploid hybrid Pennisetum

2.2 葉片表皮微形態特異性分析

雜交狼尾草新種質CHP2009－14與對照葉片上、下表皮均由氣孔器、長細胞（L）、短細胞（S）、葉脈和刺毛（T）等組成，脈間長細胞多為長形，細胞壁多具齒紋，短細胞及氣孔器分布于長細胞間，氣孔器成行分布于葉脈間隙（圖1）。

與對照三倍體雜交狼尾草相比，六倍體雜交狼尾草新種質CHP2009－14上表皮氣孔器密度減小了65.20%（P＜0.01），氣孔器長度和寬度分別增加了47.71%（P＜0.01）和51.54%（P＜0.01）；下表皮氣孔器密度減小了35.71%（P＜0.01），其氣孔器長度和寬度分別增加了30.53%（P＜0.01）和34.17%（P＜0.01）；雜交狼尾草新種質CHP2009－14葉片上、下表皮氣孔器面積均較對照雜交狼尾草有所增加，分別達到對照雜交狼尾草氣孔器面積的2.07倍和1.54倍（表3）。

圖1 CHP2009－14與三倍體雜交狼尾草葉片上下表皮氣孔特性比較Fig.1 Comparison of stoma characteristics in upper and lower leaf epidermis of CHP2009－14and triploid hybrid Pennisetum

表3 六倍體CHP2009－14與三倍體雜交狼尾草葉片表皮氣孔器特征Table 3 Stoma characteristics in upper and lower leaf epidermis of CHP2009－14and hybrid Pennisetum

2.3 流式細胞術分析

以三倍體雜交狼尾草為對照，調整儀器閾值使對照三倍體雜交狼尾草G1期峰值所在的熒光道數為200道，檢測三倍體雜交狼尾草和六倍體雜交狼尾草新種質CHP2009－14植株細胞核的DNA相對含量。結果顯示（圖2），三倍體雜交狼尾草G1期峰值位于200道附近，G2期峰值位于400道附近；新種質CHP2009－14植株的G1、G2期峰值分別位于400道和800道附近，表示其細胞核DNA含量為對照三倍體雜交狼尾草的兩倍，雜交狼尾草新種質CHP2009－14的染色體與對照相比發生了加倍。

3 討論與結論

3.1 六倍體雜交狼尾草種質創新及評價

圖2 雜交狼尾草體細胞突變體對照 （A）和CHP2009－14（B）葉片相對DNA含量分布曲線Fig.2 Distribution curve of relative DNA content of somatic mutant CK （A）and CHP2009－14（B）in leaf

多年來，人工誘導多倍體的研究一直吸引著廣大的植物育種工作者［20］。但大量的研究發現，多倍化的種質在形態、細胞學特性和分子特性方面發生的變異是多樣而復雜的［21－22］，人工誘導六倍體雜交狼尾草的研究國外有少量報道。Rajasekaran等［23］以不育系Tift23DA（2n＝2x＝14）×矮生象草品種‘N75’（2n＝4x＝28）雜交種幼穗為外植體，離體培養獲得的胚性愈傷為材料，在適宜激素組合的培養基中繼代和分化培養后的再生植株中，獲得了2株可自交結實的突變體植株，經根尖染色體計數分析，染色體數2n＝6x＝42，為六倍體雜交狼尾草突變體植株，但對突變體產生機理尚不清楚，推測可能原始外植體為嵌合體，也可能與組織培養過程有關，對2個可自交結實的六倍體雜交狼尾草突變體的植物學特征評價表明，2個六倍體雜交狼尾草株高均極顯著低于對照三倍體雜交狼尾草，葉片寬度大于等于對照，而葉片長度表現不一，1個比對照長，1個比對照短。Hanna［10］利用秋水仙素處理三倍體雜交狼尾草幼苗根獲得了可自交結實的六倍體雜交狼尾草，Hanna等［24］對狼尾草屬次級基因庫中向初級基因庫中遺傳物質轉移的研究表明，以雌雄蕊均可育的六倍體雜交狼尾草為母本或父本與美洲狼尾草雜交均可產生種子，實現次級基因庫中的象草遺傳物質向美洲狼尾草轉移。本研究中的六倍體雜交狼尾草新種質CHP2009－14，是以三倍體雜交狼尾草（Tift 23A×蘇牧2號象草）的幼穗為材料，離體培養獲得的胚性愈傷為外植體，在繼代培養基中經500mg/L秋水仙素誘導處理72h，分化培養后獲得的染色體加倍植株。與對照三倍體雜交狼尾草相比，株高極顯著降低、葉片長度極顯著減小、分蘗數和葉片厚度極顯著增加，葉片寬度與對照無顯著差異，莖葉比極顯著減小；六倍體雜交狼尾草新種質CHP2009－14具有多年生習性，盡管花藥敗育，不能自交結實，但柱頭具有可授性，正在篩選合適的二倍體美洲狼尾草恢復系與之雜交選育四倍體雜交狼尾草新品系，有關研究結果將進一步報道。

Hanna等［25］研究了倍性對雜交狼尾草產量和品質的影響，認為多倍體對產量和品質沒有影響或有負面影響，三倍體雜交狼尾草比六倍體雜交狼尾草具有更高的產量和品質。本研究結果表明，在海涂地種植的新種質CHP2009－14鮮草產量略高于三倍體雜交狼尾草，干物質產量略低于對照，差異不顯著，體外消化率顯著增加，粗蛋白含量極顯著提高。本試驗結果與Hanna等［25］的研究結果不一致，分析原因可能與種植的土地類型有關，CHP2009－14在鹽堿地種植表現優于三倍體雜交狼尾草，有關機理正在進一步研究。

3.2 六倍體雜交狼尾草新種質的鑒定方法

Hodgson等［26］提出在被子植物相當大范圍的分類單元里氣孔的大小與基因組大小呈正相關關系。Campos等［12］對獲得的17株六倍體植株、115株嵌合體植株的氣孔器特性分析表明，六倍體雜交狼尾草上下表皮氣孔器密度比三倍體雜交狼尾草減小了大約48.83%和44.83%，氣孔器面積約是三倍體雜交狼尾草的1.52倍，混倍體植株氣孔器密度和大小介于三倍體和六倍體之間。本研究結果表明，上下表皮氣孔器密度六倍體雜交狼尾草新種質CHP2009－14比三倍體雜交狼尾草減小65.2%和35.71%，CHP2009－14葉片上、下表皮氣孔器面積分別為對照三倍體雜交狼尾草氣孔器面積的2.07倍和1.54倍，與Campos等［12］的研究結果呈現相似的規律。盡管多倍體育種中根尖染色體計數是最直接的倍性鑒定證據，但由于染色體精確計數對操作技術要求極高［27］，對染色體數多的嵌合體不易識別，而流式細胞術可靈敏地檢測出嵌合體并計算不同倍性細胞所占比例［28］。本研究中流式細胞術的分析結果表明，對照三倍體雜交狼尾草有絲分裂G1期和G2期的峰值在200和400附近，而CHP2009－14有絲分裂G1期和G2期的峰值在400和800附近，表明CHP2009－14細胞核DNA含量約是對照三倍體雜交狼尾草的2倍，與CHP2009－14的染色體計數結果2n＝42相吻合。因此，在秋水仙素誘導處理三倍體雜交狼尾草胚性愈傷再生植株后，可以先進行葉片氣孔器特性分析初步篩選，然后進行流式細胞術分析，最后進行染色體計數確定，可提高六倍體雜交狼尾草新種質篩選的效率。

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