序貫移植方案在高齡不孕癥患者冷凍胚胎移植周期的臨床研究*

王 蕾，許淑芬

廈門大學附屬第一醫院生殖醫學中心，福建 廈門 361003

高齡孕婦是指孕婦在35周歲以上分娩的人群。隨著現代社會發展，職業女性多推遲生育，并且在我國二胎政策全面放開后，根據國家相關政策，符合二胎政策的育齡夫婦高達近9 000萬對，其中女性年齡在40歲以上的夫妻比例超過半數，女性年齡在35歲以上的夫妻更是高達六成，因此高齡夫婦尋求生育的人數越來越多，高齡生育是現階段許多女性需要面對的問題。在女性年齡增加的同時，高齡婦女卵巢功能下降，生殖細胞質量下降，其自然受孕幾率下降［1］，需要去醫院輔助生殖中心尋求幫助的患者越來越多。高齡不孕患者行輔助生殖技術（ART）的數量近幾年呈明顯上升趨勢，高齡女性生育問題將面臨巨大的醫學挑戰。在過去的臨床實踐中發現，高齡女性行ART助孕過程中，面臨獲卵少、可用胚胎數量少評分低、反復移植失敗、流產率及胎兒畸形率高等臨床妊娠結局不良問題。

早在1988年，國外學者就對胚胎序貫移植（SET）進行了探討［2］，國內學者亦在既往行體外受精-胚胎移植（IVF-ET）失敗患者行冷凍胚胎解凍移植（FET）中的SET 方案進行了研究［3-4］，但目前在高齡不孕患者FET 周期中應用SET方案的探討尚未見專家提出指導意見。本研究通過對生殖醫學中心高齡（年齡≥35歲）不孕女性冷凍胚胎解凍移植病例進行回顧性分析，為高齡女性FET方案選擇提供新的臨床思路，現將結果報告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2017年7月—2021年5月廈門大學附屬第一醫院生殖醫學中心行FET、年齡≥35 歲患者的150 例作為研究對象，按移植胚胎種類分為三組，A 組（序貫移植n=30）、B組（移植2枚卵裂胚n=60）和C組（移植2枚囊胚n=60）。本研究納入標準：年齡≥35 歲。排除標準：年齡＜35 歲；有宮腔黏連、子宮內膜息肉/黏膜下肌瘤、宮腔積液等。

1.2 胚胎選擇

患者冷凍/解凍胚胎按玻璃化冷凍/解凍胚胎。解凍后胚胎進行評估，卵裂胚：細胞數為7～9 個、細胞碎片＜10%、無多核化的胚胎定義為優質卵裂胚；囊胚：評分D5≥3BB、D6≥4BB的囊胚定義為優質囊胚［5-6］。

1.3 分組情況

內膜準備方案：月經及排卵規律的患者采用自然周期，陰道B超監測排卵，在B超確定排卵后D3移植卵裂期胚胎，排卵后D5 移植囊胚。月經及排卵不規律的患者采用激素替代周期準備內膜，月經周期第2～3 d 起口服芬嗎通紅片（含17β-E2，2 mg/片）4 mg/d×7 d，根據超聲、激素水平調整藥物用量，在使用芬嗎通紅片D14～15，內膜厚度在8 mm 以上，給予安琪坦200 mg/d 置陰道+達芙通20 mg/d 轉化內膜，4 d 后行D3 卵裂胚移植，6 d 后行D5/D6囊胚移植。A組（序貫移植）為排卵后第3 d或激素替代周期孕酮轉化第3 d移植1枚D3卵裂胚，排卵后第5 d移或激素替代周期孕酮轉化第5 d植1枚D5/D6囊胚。B組（移植2枚卵裂胚）為排卵后第3 d或激素替代周期孕酮轉化第3 d移植2枚D3卵裂胚。C組（移植2枚囊胚）排卵后第5 d 移或激素替代周期孕酮轉化第5 d 植2 枚D5/D6囊胚。

1.4 移植后早孕診斷

卵裂胚移植14 d、囊胚移植11 d后，抽靜脈血行人絨毛膜促性腺激素（HCG）檢查確認妊娠；繼續用藥，在移植后4周左右，超聲提示宮內見孕囊、胚芽及胎心搏動即判定為宮內妊娠，未見胚芽、胎心者，7 d 后復查彩超，若認為見胚胎、胎心則判定胚胎停育、流產。

1.5 統計學方法

采用SPSS 17.0 軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，三組間比較采用F分析。計數資料以例數和百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組患者一般臨床資料

本研究共納入FET 周期150 例，按子宮胚胎選擇準備方案分為A 組、B 組和C 組。患者年齡35～42 歲，三組患者年齡、抗繆勒管激素（AMH）、基礎性激素比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 三組患者一般臨床資料（±s）

表1 三組患者一般臨床資料（±s）

組別A組（n=30）B組（n=60）C組（n=60）F值P值年齡37.3±2.22 37.4±2.20 37.8±2.14 0.735 0.481 AMH（ng/mL）2.18±1.04 1.87±1.28 1.76±0.79 1.581 0.209 FSH（mIU/mL）8.04±2.25 8.60±2.55 8.07±1.89 1.039 0.357 LH（mIU/mL）5.81±1.82 5.15±1.15 5.29±2.12 1.489 0.229 E2（pg/mL）50.86±21.36 56.67±35.55 57.33±26.19 0.526 0.592 T（ng/dL）17.46±8.70 18.12±8.57 18.13±7.04 0.083 0.920 P（ng/mL）0.45±0.20 0.61±0.23 0.56±0.19 1.909 0.152

2.2 三組患者FET臨床結局

三組患者的臨床指標：孕酮轉化日內膜厚度、移植優質胚胎率、多胎妊娠率和早期流產率比較，差異無統計學意義（P＞0.05），但A 組患者臨床妊娠率和胚胎種植率明顯高于B、C 組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 三組患者FET臨床結局（±s）

表2 三組患者FET臨床結局（±s）

組別A組（n=30）B組（n=60）C組（n=60）F/χ2值P值轉化日內膜厚度（images/BZ_32_2167_1986_2181_2019.png±s）10.04±1.53 10.34±1.53 9.81±1.41 1.959 0.145移植優質胚胎（%）93.33 94.17 91.67 0.589 0.745胚胎種植（%）31.67 15.83 25.83 6.569 0.037妊娠（%）56.67 30.00 41.67 6.042 0.049多胎妊娠（%）11.76 5.56 24.00 2.987 0.225早期流產（%）5.88 11.11 12.00 0.456 0.796

3 討論

隨著女性年齡增加自然受孕能力開始出現斷崖式下降，流產率明顯升高。ART經過40余年發展，胚胎冷凍、解凍移植技術日益成熟，高齡患者因自身條件受限，新鮮周期移植取消率明顯高于年輕患者，冷凍胚胎解凍比率亦明顯升高。目前大多數專家學者認為，在ART周期的移植胚胎選擇方案為移植單個優質胚胎，能在保證較高妊娠率的同時能降低多胎妊娠率，是目前大多數輔助生殖中心選擇移植胚胎的主要策略。但年齡是影響妊娠結局的重要因素［7］，高齡患者由于自身條件受限，難以獲得質量較好的優質囊胚，因此胚胎移植后臨床妊娠率一直處于較低水平［8］，高齡患者移植胚胎選擇面臨更多困難。在冷凍胚胎解凍周期中，高齡不孕患者由于常常需要多個取卵周期累積胚胎，獲得優質胚胎不容易，需要個性化選擇更好的方案移植以提高妊娠率。在臨床上，FET的胚胎選擇方式主要有卵裂胚移植、囊胚移植以及卵裂胚+SET。

SET方案的研究初衷在于提高患者的胚胎種植率以增加ART的成功率，Yazbeck等［9］的研究結果發現，在反復移植失敗的患者中，冷凍胚胎解凍移植行SET妊娠結局明顯高于純卵裂期胚胎以及純囊胚移植。張印峰等［10］國內學者也得出解凍周期SET能夠顯著提高RIF患者臨床妊娠率、持續妊娠率及活產率的結論，尤其是SET 2枚胚胎在顯著提高臨床妊娠率和活產率的同時不增加多胎妊娠率，研究中認為SET 可成為RIF 患者的一種有效的治療手段。合并RIF的多囊卵巢綜合征（PCOS）患者行SET后臨床妊娠率和胚胎種植率均得到顯著提高［11］。

本研究結果顯示，在高齡不孕患者行FET 周期中，SET 組妊娠率及胚胎種植率顯著高于移植2 枚卵裂胚及2枚囊胚組。分析其原因可能有以下幾點：第一，在序貫移植中，初次行胚胎移植時移植管伸入宮腔的操作是對子宮內膜形成機械性微刺激，這可能有利于胚胎著床［12］，其機制可能是刺激子宮內膜募集可促進胚胎著床的細胞因子，如白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-8（IL-8）、γ-干擾素（IFN）、血管內皮生長因子（VEGF）等有利于增加子宮內膜容受性相關的因子分泌，以及白細胞抑制因子（LIF）、骨橋蛋白（OPN）等誘導胚胎著床相關的因子分泌。同時，巨噬細胞、樹突狀細胞、自然殺傷性細胞（NK）聚集活化增加，這能夠促進上述相關因子的分泌表達，子宮自然殺傷性細胞可以促進血管新生，增加子宮內膜和內膜下血流，利于滋養細胞侵入［13］從而提高胚胎植入提高妊娠率。第二，SET周期第一個移植的胚胎（第3 d的卵裂胚）在種植進入子宮內膜后，導致環氧合酶2（COX 2）基因表達上調，前列腺素2（PG-2）生成增加，促進血管生成，誘導組織特異性子宮NK 細胞增殖，進而調節胚胎附著、子宮內膜重塑、抗氧化防御和囊胚周圍免疫機制中的胚胎自分泌和母體旁分泌因子，增進了胚胎和內膜間的相互作用，這種作用使得內膜出現了“種植窗”狀態，促進第二次移植的胚胎植入［14］。第三，SET中由于兩次移植不同時期胚胎，第一個移植的卵裂胚種植后能誘導分泌的絨毛膜促性腺激素HCG，而HCG 的分泌促進白細胞介素-1（IL-1）分泌。IL-1作為重要的胚胎信號，多方面影響子宮內膜容受性促進胚胎著床。IL-1等細胞因子能促進白血病抑制因子（LIF）、前列腺素2（PGE2）等表達，這些細胞因子的分析均有增加子宮內膜容受性的作用，從而促進胚胎著床、提高妊娠率［15］。本研究結果還顯示，SET組的多胎妊娠率、流產率與另外兩組無顯著差異，序貫移植并未顯著增加多胎妊娠及流產風險，這與既往的研究結果一致［16-17］。

胚胎在體外培養至囊胚階段能對胚胎進行進一步的評估和篩選，但因體外培養條件的受限、高齡患者胚胎發育潛能下降等眾多因素，可能面臨無囊胚移植風險，因此高齡SET存在一定的局限性。但有在FET周期中已經有多種胚胎選擇的條件下，SET不僅可以應用在反復移植失敗患者中，還可以作為一種相對能提高妊娠率而不增加多胎率、流產率的有效方案在高齡不孕患者FET中應用，國內學者［18］在對40歲以上超高齡反復移植失敗患者冷凍胚胎SET結局的研究得到了與本次研究結果一致的結論。但是由于SET 在一次冷凍胚胎解凍周期中存在兩次胚胎解凍，兩次移植，在一定程度上增加了患者經濟及時間成本，這也是臨床工作中需要綜合考慮的問題。

綜上所述，冷凍胚胎移植周期中，SET對高齡不孕患者是一種有效的移植策略，但目前研究者收集臨床樣本量較少，還需要今后更大樣本量的臨床研究進一步探討。