Notch信號通路調控軟骨內成骨的研究現狀

脊椎動物的骨骼形成是一個復雜的過程。從間充質細胞的富集、體節的形成、軟骨內成骨或膜內成骨到骨骼的鈣化，軟骨細胞、成骨細胞和破骨細胞之間總是存在功能的平衡。軟骨內成骨作為骨骼形成的一種主要方式，受多種因素的影響，Notch通路在該過程中起到了極其重要的作用。

1 軟骨內成骨

脊椎動物的骨骼發育主要有兩種形式：一種是以顱面部骨及鎖骨為代表的膜內成骨，還有以中軸骨、四肢骨及顱底骨為代表的軟骨內成骨[1]。軟骨內成骨發生在胚胎早期，始于間充質細胞的富集，繼而形成兩種不同的細胞亞群：一個群體形成骨骼生長板，即胚胎發育的一次骨化中心，主要決定了骨的形狀；另外一群體則形成骨骺端關節軟骨，又被稱為二次骨化中心，進一步限定了骨的形狀和大小[2]。通常，骨的形狀不同，骨化的方式也有所不同，如：四肢的長骨為二次骨化形式，而椎骨則為一次骨化形成。顱底軟骨的形成及骨化類似于四肢骨，以生長板形式進行。

在間充質細胞富集區，中心區域的細胞終止增殖，進入分化，經過前肥大細胞、肥大細胞、終末肥大細胞最終分化為肥大成熟的軟骨細胞，分泌礦化的細胞外基質即形成軟骨，為下一步的骨化提供模板。軟骨由一層成纖維細胞樣細胞包裹，后者被稱為軟骨膜。當間充質細胞分化到肥大細胞階段，軟骨膜內的細胞開始分化為成骨細胞，同時軟骨膜開始轉變為血管豐富的骨膜，血管進入軟骨基質中，成骨和破骨細胞通過血管分布到軟骨基質，開始破壞軟骨基質同時分泌骨基質，形成松質骨，存留在骨膜中的成骨細胞則分泌高度鈣化的基質形成皮質骨[1]。

2 Notch信號通路

胚胎軟骨發育受復雜多變的信號通路綜合調節，從現有知識體系來看，主要包括Ihh、BMP、FGF、Wnt、Notch等信號通路[1]。其中，Notch通路通過調節胚胎期干細胞的增殖、分化與凋亡過程，參與調控哺乳動物胚胎體節發生[3]、胚胎神經系統及消化系統的發育[4]，并在腫瘤的發生過程中扮演了重要的角色，現在已成為腫瘤治療研究的新靶點[5]。近年來，研究者們開始關注該通路在骨發育過程中的作用。Notch基因最初在果蠅體內發現[6]，隨后眾多的研究證明其廣泛存在且高度保守。在哺乳動物，Notch受體包括Notch1-4四種，配體主要有Delta-like1、3、4和Jagged1、2共五種。作為一種跨膜蛋白受體，Notch配體首先在內質網中轉錄翻譯形成初級蛋白并被運輸到高爾基體，其中的蛋白轉化酶（protein convertases）在Notch1初級蛋白S1位點進行剪切，隨后糖基化轉移酶（glycosyltransferases）對其進行不同的糖基化修飾，從而影響配體和受體結合后的不同反應[6]。Notch與相鄰細胞上的配體結合后，膜旁負性調節區域（juxtamembrane negative control region，NRR）展開，α-secretase識別該區域并在S2位點剪切掉Notch的胞外段，隨后γ-secretase在胞內段S3位點的剪切最終產生胞內片段NICD。NICD直接進入細胞核內，與CSL（DNA結合蛋白，不同種屬中名稱不同）結合，然后募集Maml（NICD的共同激活因子）、結合組蛋白乙酰化酶和核染色質改建復合物等形成復合體，解除CSL對目標基因的轉錄抑制作用，并最終產生生物學效應[7]。

3 Notch信號通路對軟骨內成骨的影響

3.1體內試驗：胚胎12.5天（E12.5）的小鼠前肢芽區開始出現成軟骨祖細胞的聚集，此時整個干細胞聚集區都呈現Notch1陽性信號，而到16.5天（E16.5），軟骨分化成熟時，Notch1陽性細胞只分布于軟骨的邊緣區域[8]。這提示其可能參與調控軟骨內成骨全過程。進一步的模型動物研究表明：Notch過表達（Gain of function）的小鼠總體表現出圓頭短吻、胸廓小、軀干及尾部短的特點，阿辛藍-茜素紅染色顯示整體軟骨發育不全，通過軟骨內成骨方式形成的骨普遍體積較小且長度不足，肢端幾乎沒有骨化中心存在，且這種轉基因小鼠均為胚胎期致死[9-10]。也有研究者通過過表達配體激活內源性Notch通路，進一步觀察軟骨內成骨過程的變化。研究發現，在雞胚上肢區域用逆轉錄病毒過表達Del-1后，早期上肢的發育形態并無改變，而在胚胎7天以后，大小上的差異逐漸明顯起來，肢端出現畸形。值得注意的是，Notch通路的配體在脊椎動物有五種，其中一種配體的升高并不能全面解釋經典Notch通路在軟骨發育中的作用[11]。因為不同配體的表達具有階段性，故以不同配體過表達方式進行研究有利于揭示Notch通路在骨發育不同階段的影響。這一方面的研究值得進一步深入。同時，因為Notch通路在胚胎的各個系統發育，尤其是神經系統發育中有重要的作用，因此，全身敲除Notch導致胚胎早期致死，無法進行后續研究，而條件性基因敲除策略或許可以避免這一缺點，為后續的骨發育研究創造條件。

3.2體外實驗：間充質干細胞、胚胎肢芽微聚體等原代細胞有向軟骨細胞分化的潛能，常被用于軟骨分化機制的研究。ATDC5細胞系（小鼠畸胎瘤成纖維細胞系）在胰島素的誘導下發生軟骨向分化[12]。ATDC5細胞在誘導早期即開始表達Notch1和相應的配體Del1[8]，這種表達的時間模式與原代細胞的培養結果相似，也類似于體內試驗中動物早期干細胞富集區Notch1的表達模式[8]。運用該體外模型，有利于探索Notch信號通路對軟骨向分化調控的機制。首先，Notch通路的激活有利于細胞的增殖：在配體Del的激活Notch信號通路的情況下，小鼠間神經嵴細胞克隆的直徑明顯增大，細胞數目顯著增加[13]。其次，在促進細胞增殖的同時，Notch也可調控體外培養細胞的軟骨向分化能力。與高表達Del1的D10細胞共培養時，ATDC5細胞軟骨結節及細胞外基質形成明顯減少[8]；相反，通過DAPT（γ蛋白酶阻斷劑）阻斷Notch通路后，肢芽微聚體及間充質干細胞中NICD量明顯下降，軟骨向分化能力增強，表現為軟骨結節的表達增多[14-15]；實驗從正反兩方面說明，Notch信號通路的激活能維持細胞系的增殖潛能，抑制軟骨向分化。值得注意的是ATDC5細胞系軟骨源性的細胞系，并非多能干細胞。

同樣，利用JAG1過表達的質粒使hMSC的Notch通路持續激活，則細胞會維持在聚合體狀態，不再繼續分化為成熟的圓形肥大細胞[2]。有趣的是，在小鼠神經嵴細胞成軟骨誘導初始即刻添加Delta-Fc，軟骨結節更豐富，24h后再添加相同劑量Delta-Fc，成軟骨情況不會改善[13]。兩種相反的實驗結果表明了Notch通路作用時間及細胞所處分化階段的重要性。最新的研究對Notch表達時期的重要性進行了探索，Rachel等利用人間充質干細胞3D聚體培養進行成軟骨向誘導，發現Notch通路配體Jag-1及目標基因Hey-1的表達從誘導開始便急劇上升，并在第2天到達最高值，之后迅速下降，在表達下降后，才開始出現軟骨分化標志物Col-II的上升。利用DAPT早期阻斷Notch通路可有效降低軟骨形成，同時若誘導后期Jag-1過表達持續激活Notch通路，則軟骨的形成受到抑制。Notch通路的早期激活開啟了干細胞的軟骨向分化，但在分化后期持續表達卻能抑制進一步分化進行，從而維持前體細胞狀態[16]。目前，對Notch通路調節細胞凋亡作用的研究主要集中在腫瘤發生發展領域，Notch通路能夠抑制腫瘤細胞的凋亡，現已成為腫瘤治療的新靶點[17]。而 Notch通路對ATDC5凋亡影響的初步研究表明其對凋亡沒有明顯影響[8]。

綜上所述，體內外實驗研究表明，Notch能夠促進細胞的增殖，啟動早期分化，維持前體細胞的干性，抑制細胞的進一步分化成熟，與軟骨內成骨過程密切相關。

4 Notch通路與其他通路的相互作用

作為一條高度保守的重要通路，Notch通路調節各個系統的生長發育，只依靠自身有限的受體配體作用，不足以解釋其控制發育過程的復雜性，因此通路之間的相互調節共同作用也是十分重要的。在軟骨發育中，主要的調節通路包括Sox9、BMP、FGF等可能與Notch通路有交互作用。有研究表明，Jag1通過激活Notch通路抑制Sox9的表達，另一方面，Notch也直接抑制Sox9的目的基因，兩條途徑共同作用抑制hMSC的軟骨向分化[16]。另外，研究發現FGF2能促進小鼠MSC成軟骨向分化，阻斷Notch通路后，其促進成軟骨向分化能力減弱，表現為Col-II表達減少，而利用SU5402阻斷FGF通路后，Del-Fc激活Notch通路可部分解除對Col-II的表達抑制，這說明FGF2的部分功能可以通過Notch通路行使[13]。再者，DAPT處理細胞抑制Notch通路后，BMP4表達未受影響，但相應的下游蛋白Id1表達卻有了相當的升高，這可能是由于BMP4位于Notch上游并通過其抑制成軟骨向分化過程[14]。很多證據表明Notch在影響軟骨分化的過程中與其他通路有著密切的聯系和相互作用，這是一個復雜而精細的調控網絡，具體的機制還有待進一步探討。

5 結論

軟骨內成骨過程中，Notch通路作用的細胞及分子生物學機制是非常復雜的，不同時期配體的調控、與其他通路的相互作用等在Notch行使功能時扮演了重要角色。越來越多的研究表明，Notch通路在控制干細胞的增殖和軟骨向分化、維持細胞的干細胞活性、保持基質的平衡方面起了重要的作用，而其中的具體機制仍有待探索。深入研究Notch通路對軟骨內成骨的影響有利于人們進一步理解生命發展過程，為各種先天性骨、軟骨發育不全等骨畸形的預防性診斷及治療開辟途徑。

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編輯/李陽利