LC—MS/MS測(cè)定甲磺酸伊馬替尼中的伊馬胺

[摘要] 目的 建立高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定甲磺酸伊馬替尼中基因毒性雜質(zhì)伊馬胺的方法。 方法 選用C18色譜柱（3.5μm，150mm×3.0mm），以0.05%甲酸的乙腈-20mmol/L甲酸銨為流動(dòng)相，采用梯度洗脫進(jìn)行分離，流速：0.5mL/min；柱溫為40℃；進(jìn)樣量10μL。對(duì)照品溶液選用TSQ Quantum Ultra質(zhì)譜儀的選擇離子檢測(cè)（SIM）掃描方式進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果 該方法在2.5～100.0ng/mL范圍內(nèi)線性良好（0.998），定量限和檢出限分別為2.5ng/mL和1.0ng/mL，方法回收率97.1%，穩(wěn)定性較好。 結(jié)論 本研究所建立的方法快速、靈敏、專屬性強(qiáng)，適用于甲磺酸伊馬替尼中基因毒性雜質(zhì)伊馬胺的測(cè)定。

[關(guān)鍵詞] 甲磺酸伊馬替尼；LC-MS/MS；基因毒性雜質(zhì)；伊馬胺

[中圖分類號(hào)] R927 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 2095-0616（2013）20-36-03

甲磺酸伊馬替尼（imatinib mesylate）是瑞士Novartis公司研發(fā)的Bcr-Abl酪氨酸激酶受體抑制劑，2001年首次在美國上市[1]，商品名Gleevec。臨床主要用于治療慢性髓性白血病（chronic myelogenous leukemia，CML）急變期[2-3]、加速期或α-干擾素治療失敗后的慢性期患者和治療不能切除和發(fā)生轉(zhuǎn)移的惡性胃腸道間質(zhì)腫瘤（GIST）的成人患者[4]，治療效果得到了廣泛的認(rèn)可。伊馬胺化學(xué)名N-（5-氨基-2-甲基苯基）-4-（3-吡啶基）-2-嘧啶胺是合成甲磺酸伊馬替尼合成的中間體[5-7]，屬于潛在的基因毒性雜質(zhì)[8-9]。根據(jù)美國食品和藥物管理局（FDA）和國際藥品注冊(cè)協(xié)調(diào)會(huì)議（ICH）關(guān)于基因毒性雜質(zhì)的指導(dǎo)原則要求[10-11]，本資料擬建立采用LC-MS/MS測(cè)定本品合成中間體伊馬胺的含量方法。

1 儀器與試劑

儀器：XS105電子分析天平（瑞士METTLER公司）；UltiMate 3000高效液相色譜儀（美國戴安公司）；TSQ Quantum Ultra三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源（美國Thermo Scientific公司）。

試劑：甲酸（色譜純，F(xiàn)luka公司）；乙腈（色譜純，F(xiàn)isher公司）；甲酸胺（色譜純，上海安譜科學(xué)儀器公司）；超純水（屈臣氏）；伊馬胺（含量99.7%，本公司自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件：照高效液相色譜法（中國藥典2010年版二部附錄ⅤD），用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲酸銨緩沖液（取甲酸銨1.26g，加水1000mL溶解后，用甲酸調(diào)節(jié)pH值至3.4～3.5）為流動(dòng)相A，含有0.05%甲酸的乙腈為流動(dòng)相B；流速為0.5mL/min，梯度洗脫程序t：0-6-10-15-15.1-25min，流動(dòng)相比例B%：20%-20%-80%-80%-20%-20%，柱溫為40℃，進(jìn)樣量為10μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧（ESI）電離源，正離子方式檢測(cè)；噴霧電壓：3.0kV；氣化溫度：300℃；鞘氣（N2）壓力：30arb；輔助氣（N2）壓力：5arb；離子傳輸管溫度：300℃；掃描方式為選擇離子檢測(cè)（SIM），用于定量分析的檢測(cè)離子為m/z：277.8。

2.2 溶液配制

2.2.1 供試品溶液 取甲磺酸伊馬替尼適量，精密稱定，用水-乙腈（70︰30）溶解并定量稀釋制成每毫升中約含5mg的溶液，作為供試品溶液。

2.2.2 對(duì)照品儲(chǔ)備液 取伊馬胺對(duì)照品約25mg，精密稱定，用水-乙腈（70︰30）溶解并定量稀釋成每毫升中約含500ng的溶液搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

2.3 分析方法確證

2.3.1 質(zhì)譜分析 將對(duì)照品溶液采用蠕動(dòng)泵進(jìn)樣模式，進(jìn)行全掃描（full scan）形式分析檢測(cè)，相應(yīng)的質(zhì)譜圖見圖1。

胺對(duì)照品溶液的選擇離子掃描質(zhì)譜圖

2.3.2 方法的專屬性 在所確定的2.1色譜-質(zhì)譜條件下，對(duì)空白溶液（水-乙腈=70︰30）和伊馬胺對(duì)照溶液100ng/mL，）進(jìn)行檢測(cè)，考察方法的專屬性，色譜圖見圖2。結(jié)果表明：在2.1色譜-質(zhì)譜條件下，空白溶液不干擾伊馬胺雜質(zhì)的檢測(cè)，專屬性良好。

2.3.3 線性關(guān)系考察 精密量取伊馬胺對(duì)照品儲(chǔ)備液0.25、0.5、1、5、10mL置50mL量瓶中，用稀釋液稀釋定容至刻度，分別配制成濃度為2.5、5、10、50、100ng/mL的溶液，精密量取上述溶液各10μL，分別注入液相色譜質(zhì)譜儀中，采用2.1確定的色譜-質(zhì)譜條件檢測(cè)，記錄色譜圖，量取峰面積。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，線性回歸方程為：A=146470600×C-221088，r=0.998，說明本品在2.5～10ng/mL范圍內(nèi)線性良好。測(cè)定結(jié)果見下表1。

2.3.4 定量限與檢測(cè)限 在2.3.3試驗(yàn)條件下，配制不同濃度伊馬胺對(duì)照品，檢測(cè)限以S/N≥3計(jì)，定量限以S/N≥10計(jì)，分別進(jìn)樣確定伊馬胺的檢測(cè)限和定量限，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見下表2。

2.3.5 方法準(zhǔn)確度 稱取甲磺酸伊馬替尼約125mg，置25mL量瓶中，作為回收率基質(zhì)樣品；稱取伊馬胺約25mg，置50mL的量瓶中，用水-乙腈（70︰30）溶解并稀釋定容至刻度，搖勻，精密量取該溶液1.0mL置100mL量瓶中，用水-乙腈（70︰30）稀釋至刻度，精密量取該溶液1.0mL置100mL量瓶中，用水-乙腈（70︰30）稀釋至刻度作為伊馬胺雜質(zhì)溶液。以伊馬胺的含量（0.0002%基質(zhì)樣品濃度）為基準(zhǔn)100%，分別精密量取伊馬胺雜質(zhì)溶液2.5、5.0、10.0mL分別置于盛有基質(zhì)樣品的25mL量瓶中，混勻，用水-乙腈（70︰30）稀釋定容，配制成含伊馬胺雜質(zhì)50%、100%、200%的溶液，同法平行3次，作為供試品溶液。

精密量取上述溶液各10μL，分別注入液相色譜質(zhì)譜儀中，采用2.1確定的色譜-質(zhì)譜條件檢測(cè)，記錄色譜圖，量取峰面積（其中供試品中伊馬胺的峰面積需扣除樣品基質(zhì)中伊馬胺的峰面積），計(jì)算回收率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

從上述系列表可以看出，伊馬胺測(cè)定平均回收率為97.1%，RSD為3.75%（n=9），表明該方法檢測(cè)伊馬胺的準(zhǔn)確度很好。

3 結(jié)論

采用LC-MS/MS法測(cè)定藥物中的基因毒性雜質(zhì)具有選擇性好，靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，目前正越來越多的應(yīng)用于新藥研發(fā)中遺傳毒性雜質(zhì)的分析中[12-14]。基于伊馬胺為甲磺酸伊馬替尼為合成中間體同時(shí)也是潛在的降解產(chǎn)物，該雜質(zhì)可能具有基因毒性含量低（小于2ppm），因而對(duì)其檢測(cè)方法提出了更高的要求。應(yīng)用單一的HPLC方法[15]，采用紫外檢測(cè)器最低的檢測(cè)限度為20ppm，而采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，以選擇

離子檢測(cè)（SIM）監(jiān)測(cè)方式掃描檢測(cè)，具有極高的靈敏度，最低檢測(cè)限度可達(dá)到0.2ppm，該檢測(cè)方法簡單、快速、方法靈敏度和準(zhǔn)確度高，實(shí)用性強(qiáng)，為相關(guān)的藥品檢測(cè)工作提供了快速準(zhǔn)確的技術(shù)支持，可為藥品安全，保證人體健康提供技術(shù)保障。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Cohen MH，Williams G，Johnson JR，et al.Approval summary for imatinib mesylate capsules in the treatment of chronic myelogenous leukemia[J].Clin Cancer Res，2002，8（5）：935-942.

[2] 鄭斌，危晴嵐，劉茂柏，等.甲磺酸伊馬替尼臨床研究概況[J].海峽藥學(xué)，2006，18（6）：78-80.

[3] 吳榮娟，馬旭東.甲磺酸伊馬替尼的耐藥機(jī)制及逆轉(zhuǎn)策略[J].醫(yī)學(xué)綜述，2011，17（22）：3460-3463.

[4] 王晨.甲磺酸伊馬替尼抗腫瘤作用研究[J].天津藥學(xué)，2005，17（4）：63-65.

[5] 陳敖，黃荷香，宋帥娟，等.甲磺酸伊馬替尼的合成[J].精細(xì)與專用化學(xué)品，2007，15（8）：23-25.

[6] 王保國，劉玉鳳，狄國杰，等.甲磺酸伊馬替尼的合成[J].濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，35（2）：100-102.

[7] 付利強(qiáng)，王鵬，程卯生，等.甲磺酸伊馬替尼合成路線圖解[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜質(zhì)，2008，39（10）：786-787.

[8] 王棋，宋銳，費(fèi)夢(mèng)瑩，等.梯度洗脫HPLC法測(cè)定甲磺酸伊馬替尼的含量及有關(guān)物質(zhì)[J].海峽藥學(xué)，2012，24（3）：58-60.

[9] Giordani A，Kobel W，Gally HU. Overall impact of the regulatory requirements for genotoxic impurities on the drug development process[J].Eur J Pharm Sci，2011，43（1-2）：1-15.

[10] Raman NVVSS，Prasad AVSS，Reddy KR. Strategies for the identification， control and determination ofgenotoxic impurities in drug substance：A pharmaceutical industryperspective [J].J Pharm Biomed Anal，2011，55（4）：662-667.

[11] 張園園，李銀峰，王杰晶，等.藥物中痕量磺酸酯類物質(zhì)的檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J].藥物評(píng)價(jià)研究，2012，35（4）：304-306.

[12] Kakadiya PR，Reddy BP，Singh V，et al.Low level determinations of methyl methanesulfonate and ethyl methanesulfonate impurities in Lopinavir and Ritonavir active pharmaceutical ingredients by LC/MS/MS using electrospray ionization[J].J Pharm Biomed Anal，2011，55（2）：379-384.

[13] Montesano MA，Whitehead JRD，Jayatilaka NK，et al. Measurement of methyl methanesulfonate in humaan plasma and breast milk samples using high-performance liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionization-tandem mass spectrometry[J].J Pharm Biomed Anal，2010，52（2）：260-264.

[14] An V，Sun M，Bai L，et al. A practical derivatization LC/MS approach for determination of trace level alkyl sulfonates and dialkyl sulfates genotoxic impurities in drug substances [J].J Pharm Biomed Anal， 2008，48（3）：1006-1010.

[15] Oostendorp RL，Beijnen JH，Schellensi HM，et al. Determination of imatinib mesylate and its main metabolite （cgp74588） in human plasma and murine specimens by ion-pairing reversed-phase high-performance liquid chromatography[J].Biomed Chromatogr Published Online，2007，27（3）：34-36.

（收稿日期：2013-07-12）