哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究概況

【摘 要】本文闡述了哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究概況，主要介紹了哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的主要技術(shù)環(huán)節(jié)、哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)存在的主要問(wèn)題及其發(fā)展前景。

【關(guān)鍵詞】哺乳動(dòng)物；轉(zhuǎn)基因技術(shù)；問(wèn)題；發(fā)展前景

1980年，Gordn等人用顯微注射轉(zhuǎn)基因方法獲得了兩只轉(zhuǎn)基因小鼠。1982年，Palmiter和Brinster用此方法把大鼠的生長(zhǎng)激素基因?qū)胄∈笫芫阎校@得體重是對(duì)照組2倍的“超級(jí)鼠”。[1]從此，哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)迅速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因兔、綿羊、豬等相繼問(wèn)世。哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)實(shí)現(xiàn)了哺乳動(dòng)物間遺傳物質(zhì)的交換和重組，已成為分子生物學(xué)研究的基本技術(shù)，并廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的主要技術(shù)環(huán)節(jié)介紹如下。

1 目標(biāo)基因克隆和體外重組[1]

1.1 人工合成

它是用DNA合成儀人工合成小片段堿基序列，一般不超過(guò)100個(gè)堿基。

1.2 互補(bǔ)DNA的克隆

提取組織中的mRNA，用反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，建cDNA立文庫(kù)，再克隆目標(biāo)蛋白的cDNA。

1.3 DNA的克隆

首先通過(guò)基因克隆技術(shù)獲得編碼目標(biāo)蛋白的基因，再把目標(biāo)基因與表達(dá)載體相連接，從而形成一個(gè)獨(dú)立表達(dá)的調(diào)控單元，再通過(guò)擴(kuò)增和純化，使DNA達(dá)到一定濃度后就可以用于基因?qū)搿?/p>

2 外源基因的導(dǎo)入

2.1 DNA顯微注射

此方法是借助顯微操作儀將在體外構(gòu)建的目的基因直接注射到處于原核時(shí)期的受精卵的原核中，使這種外源基因整合到受體細(xì)胞的基因組中，以達(dá)到轉(zhuǎn)基因的目的。這種方法效果穩(wěn)定，但操作復(fù)雜，轉(zhuǎn)基因效率低。

2.2 反轉(zhuǎn)錄病毒感染法

將外源基因重組到載體轉(zhuǎn)錄病毒上，包裝成高濃度病毒顆粒，然后去感染受精卵或著床后的胚胎，也可將它們進(jìn)行單層共培養(yǎng)。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是宿主范圍廣且呈單一位點(diǎn)單拷貝整合，整合效率高，但載體病毒DNA序列有時(shí)會(huì)對(duì)外源基因在受體中的表達(dá)產(chǎn)生影響，并且它的安全問(wèn)題也令人擔(dān)憂(yōu)[4]，不易用于商業(yè)性轉(zhuǎn)基因動(dòng)物[6]。

2.3 胚胎干細(xì)胞法

這種方法是用外源基因轉(zhuǎn)化胚胎干細(xì)胞，通過(guò)篩選，把陽(yáng)性細(xì)胞注入受體動(dòng)物的囊胚腔[1]或桑椹胚的卵周隙形成嵌合體，它會(huì)很快地與受體胚囊的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)聚集在一起，共同參入正常胚泡的發(fā)育。這種方法的整合率高，但胚胎干細(xì)胞細(xì)胞株不易建立，所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物全為嵌合體。目前，研究者們正試圖把胚胎干細(xì)胞的細(xì)胞核移入去核的受精卵中來(lái)獲得非嵌合體[4]。

2.4 細(xì)胞核移植法

首先用外源DNA對(duì)培養(yǎng)的體細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，然后選陽(yáng)性細(xì)胞作核供體，通過(guò)細(xì)胞核移植獲得基因動(dòng)物。該方法的應(yīng)用還依賴(lài)于體細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展[1]。

此外還有精子載體法、基因槍法、電脈沖法、磷酸鈣共沉淀法等其他方法[4]。

3 外源DNA整合、轉(zhuǎn)錄與表達(dá)的分子檢測(cè)[1]

3.1 外源DNA整合檢測(cè)

常用方法是用目標(biāo)基因的一段序列作引物，用PCR儀擴(kuò)增目標(biāo)DNA，再通過(guò)電泳初步檢測(cè)是否含目標(biāo)基因，最后用Southern雜交檢測(cè)PCR陽(yáng)性個(gè)體是否含有目標(biāo)基因，如出現(xiàn)陽(yáng)性，就可斷定轉(zhuǎn)基因?yàn)殛?yáng)性動(dòng)物。

3.2 外源基因的轉(zhuǎn)錄檢測(cè)

該方法是用Nouthern雜交法對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物某一組織的mRNA進(jìn)行分析檢測(cè)，出現(xiàn)陽(yáng)性則表明外源基因具有轉(zhuǎn)錄活性。

3.3 外源基因的表達(dá)檢測(cè)

該方法是檢測(cè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物組織中是否含有目的基因編碼的外源蛋白質(zhì)，常用的方法有酶聯(lián)免疫法、免疫熒光法和Western雜交法。

4 轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物研究面臨的問(wèn)題

4.1 轉(zhuǎn)基因技術(shù)存在的主要問(wèn)題

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的外源基因經(jīng)常是隨機(jī)整合和異常表達(dá)的，其整合率與表達(dá)率極低，同時(shí)，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的多病、不育以至死亡都制約著轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的開(kāi)發(fā)前景[4]。

4.2 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的安全性問(wèn)題

（1）具有某些優(yōu)勢(shì)性狀的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可能會(huì)對(duì)生態(tài)平衡以及物種的多樣性產(chǎn)生不良影響；（2）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物器官移植可能會(huì)增加“人獸共患”病的傳播機(jī)會(huì)；（3）用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)的食物有可能使食用者發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)；（4）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究還將會(huì)引發(fā)一系列社會(huì)倫理問(wèn)題[6]。

5 哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展前景

5.1 哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)可用來(lái)改良動(dòng)物品種及其生產(chǎn)性能[6]

我們可以利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)讓外源基因在家畜乳腺中特異性地表達(dá)，以此提高奶液的蛋白含量和抗菌能力，降低乳糖含量，使其品質(zhì)更接近人奶。

5.2 用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)藥物蛋白[6]

把藥用蛋白或營(yíng)養(yǎng)蛋白質(zhì)與組織特異性表達(dá)調(diào)控元件藕聯(lián)，運(yùn)用家畜的造血系統(tǒng)或泌乳蛋白生產(chǎn)藥用或營(yíng)養(yǎng)蛋白質(zhì)，提高畜牧業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。

5.3 為人類(lèi)器官移植提供供體

探索用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的器官作為人類(lèi)器官移植的供體，為器官的異體移植提供基礎(chǔ)，利用此項(xiàng)技術(shù)可解決器官移植中供體相對(duì)不足的問(wèn)題。

5.4 建立診斷、治療人類(lèi)疾病及新藥篩選的動(dòng)物模型[6，13]

利用此項(xiàng)技術(shù)，遺傳學(xué)家可以精確地失活某些基因（如“knock—out”）或增強(qiáng)修復(fù)（如“knock—in”）某些基因的表達(dá)，從而制作各種研究和治療人類(lèi)疾病的動(dòng)物模型和新藥的篩選模型。

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