淺談基層畜牧獸醫(yī)站實驗室常規(guī)ELISA檢測操作注意事項

摘要：介紹了實驗室常規(guī)ELISA試驗的基本原理、操作要領(lǐng)及注意事項，供基層畜牧獸醫(yī)站工作人員參考。

關(guān)鍵詞：ELISA試驗；實驗室診斷；操作注意事項

中圖分類號：S852.5+3 文獻標(biāo)識碼：B 文章編號：1007-273X（2013）12-0069-02

近年來，隨著國家動物疫病檢測計劃的實施和地方動物疫病預(yù)防控制工作的科學(xué)化管理，獸醫(yī)實驗室發(fā)揮著越來越重要的作用。目前獸醫(yī)實驗室診斷主要分三大類：病毒學(xué)診斷、血清學(xué)診斷及細菌學(xué)診斷。細菌學(xué)與病原學(xué)檢測工作在基層實驗室開展得不多，使用最普遍的是血清學(xué)診斷，尤其是ELISA診斷試劑盒，一次可診斷幾十份血清，無論檢測抗體還是抗原，都十分方便、快速有效。對ELISA試驗的基本原理、操作要領(lǐng)及注意事項進行了介紹，供參考。

1 ELISA的基本原理與類型

ELISA是一種免疫測定技術(shù)。免疫測定技術(shù)是應(yīng)用免疫學(xué)技術(shù)測定標(biāo)本的方法。在臨床檢驗中主要通過抗原抗體反應(yīng)檢測體液中的抗體或抗原性物質(zhì)。ELISA既可用于測定抗體，也可用于檢測抗原。根據(jù)檢測目的和操作步驟的不同，有以下四種類型的常用方法：直接法、間接法、雙抗體夾心法、競爭法。

2 ELISA試驗的特點

ELISA試驗主要有以下幾個特點：①靈敏度高、特異性強；②方法快速、簡便；③重復(fù)性好；④自動化程度高，適合批量標(biāo)準(zhǔn)化檢測；⑤安全可靠。

3 ELISA試驗的操作要領(lǐng)[1，2]

3.1 樣品的采取和保存

3.1.1 樣品種類 體液、組織、分泌物和排泄物。

3.1.2 樣品要求 新鮮、無溶血、無沉淀、均勻。

3.1.3 樣品采取與保存 盡量避免溶血；血清標(biāo)本的制備：非抗凝自然凝固1～2 h，3 000 r/min離心15 min；血漿標(biāo)本的制備：使用含有抗凝劑的采血管采血，顛倒混勻放置一段時間后，3 000 r/min離心15 min；標(biāo)本宜在新鮮時檢測，若5 d內(nèi)檢測，可使用冰箱于2～8 ℃保存，超過1周時間測定，應(yīng)于-20 ℃低溫凍存；反復(fù)凍溶會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標(biāo)本如需保存做多次檢測，宜少量分裝凍存。

3.2 試劑的準(zhǔn)備

嚴格按要求準(zhǔn)備試劑；使用新制的蒸餾水或去離子水；自配緩沖液應(yīng)用pH計測量較正；冷藏試劑應(yīng)平衡至室溫后使用；試劑盒中暫時不用的部分應(yīng)及時放回冰箱。

3.3 加樣

盡量使用多道移液器；微量加樣器應(yīng)注意保養(yǎng)并定期校正；加樣前應(yīng)使溶液充分混勻，并將液體加在孔底，避免加在孔壁上部，注意不可出現(xiàn)氣泡。加樣時避免樣本濺出，如有樣本濺出孔外時，應(yīng)用吸水紙輕輕拭干，并做相應(yīng)記錄。加樣后微孔板應(yīng)及時溫育，盡量縮短加樣后溫育前的等待時間。

3.4 保溫孵育

3.4.1 溫度 37 ℃、室溫（20～25℃）和4 ℃；溫度要恒定、準(zhǔn)確。

3.4.2 保溫方式 水浴保溫時，ELISA板底應(yīng)貼著水面，加蓋避免蒸發(fā)；保溫箱保溫時為避免蒸發(fā)，用濕盒或用塑料貼封紙覆蓋板孔；反應(yīng)板不宜疊放。

3.5 洗滌

3.5.1 目的 清除殘留在板孔中未結(jié)合的物質(zhì)；清除非特異吸附于固相載體的干擾物。

3.5.2 要求 洗滌要充分；排凈；避免干燥。

3.6 顯色和比色

3.6.1 顯色 顯色是酶促反應(yīng)，溫度和時間應(yīng)力求準(zhǔn)確；顯色反應(yīng)應(yīng)避光進行。

3.6.2 比色 酶標(biāo)板的放置要正確；要選用產(chǎn)物的敏感吸收波長；以空白孔調(diào)零或雙波長式測讀可減少誤差。

4 ELISA試驗的常見問題及分析

ELISA操作是需要非常細心的工作。操作者在進行ELISA操作前應(yīng)該對試驗有充分的了解，并對預(yù)期結(jié)果十分清楚。實驗室ELISA 試驗失敗的原因有10%左右是由于水質(zhì)量引起的，另外90%則是操作上的失誤引起的，包括未意識到的操作失誤，或者明知操作原則但想偷懶而未按正確要求操作；另外，還有少量失敗案例是由于設(shè)備的管理不當(dāng)或設(shè)備狀況太差引起的[3]。

在大多數(shù)ELISA試驗中，最終都要通過酶標(biāo)儀讀數(shù)。在得出的數(shù)據(jù)中可以重點關(guān)注陰陽對照的2組數(shù)值，這可以在一定程度上反映試驗的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。可以通過計算陰性對照組和陽性對照組各自的變異系數(shù)來反映試驗的重復(fù)性和準(zhǔn)確性，如果變異系數(shù)小于20%則說明操作的重復(fù)性較好，操作較準(zhǔn)確，反之則重復(fù)性較差，操作不當(dāng)。也可以通過一個樣品的重復(fù)檢測來反映試驗操作的準(zhǔn)確性，這樣可以盡可能排除操作方面的因素對試驗結(jié)果的影響，提高檢測的準(zhǔn)確性。

參考文獻：

[1] 李純玲. 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）在畜禽飼養(yǎng)及疾病診斷中的應(yīng)用[J]. 當(dāng)代畜牧，2005（7）：20-22.

[2] 焦 奎，張書圣. 酶聯(lián)免疫分析技術(shù)及應(yīng)用[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2004.

[3] 王海霞， 陳婷飛， 盧黎明， 等.寧波市基層獸醫(yī)試驗室試劑盒使用現(xiàn)狀調(diào)查[J].浙江畜牧獸醫(yī)，2008（6）：19-20.