一例奶牛支原體和大腸桿菌混合感染的診斷報告

摘要：介紹了一例奶牛支原體和大腸桿菌混合感染病例的診治情況。通過實驗室檢查，對該牛場送檢病牛的各種臟器組織分別進行了病原微生物學檢查、病原體的分離培養(yǎng)、主要致病菌的分離鑒定、細菌純培養(yǎng)物的染色鏡檢、藥物敏感性試驗等檢測項目，確診為由支原體和致病性大腸桿菌混合感染所致的傳染性病例。

關鍵詞：支原體；大腸桿菌；混合感染；實驗室診斷；奶牛

中圖分類號：S858.23 文獻標識碼：A 文章編號：1007-273X（2013）12-0005-03

近年來，寧夏地區(qū)多個奶牛場發(fā)生了以呼吸系統(tǒng)疾病和關節(jié)腫大為主要特征的病例，病牛表現(xiàn)為突然發(fā)病甚至死亡，對牛場產(chǎn)奶量造成巨大的經(jīng)濟損失[1]。2013年6月寧夏回族自治區(qū)銀川市某奶牛場發(fā)生了一起以成年母牛張口呼吸，呼吸頻率顯著增加，右前肢關節(jié)腫大導致死亡，隨后一只3月齡犢牛同樣出現(xiàn)呼吸道癥狀并且死亡。對該牛場送檢病牛的各種臟器組織，分別進行了病原微生物學檢查、病原體的分離培養(yǎng)、主要致病菌的分離鑒定、細菌純培養(yǎng)物的染色鏡檢、藥物敏感性試驗等檢測項目，確診為由支原體和致病性大腸桿菌混合感染所致的傳染性病例，現(xiàn)將結果報告如下。

1 臨床癥狀

成年母牛呼吸異常，出現(xiàn)張口呼吸，呼吸頻率顯著增加，可見右前肢關節(jié)腫大，于產(chǎn)前2周發(fā)生流產(chǎn)；犢牛表現(xiàn)為精神不振，出現(xiàn)呼吸道癥狀，關節(jié)明顯腫大。

2 病理學診斷

解剖病死牛觀察其病理變化。成年母牛肺臟蒼白，體積顯著萎縮，表面多皺褶，肺間質(zhì)顯著萎縮，肺臟缺乏充盈感或膨脹感；肺門淋巴結略有腫大、充血，切面暗紅色（圖1）；右前肢關節(jié)液顯著增多，顏色發(fā)黃甚至渾濁；肝臟顏色變深，質(zhì)地變脆，體積腫大邊緣鈍厚，在不同部位呈現(xiàn)大小不等灰白色炎性病灶（圖2）。發(fā)病犢牛經(jīng)剖檢后，可觀察到病牛肺臟體積腫大，出現(xiàn)纖維素性炎癥及出血性炎癥，質(zhì)地結實，切面多見血沫或液體（圖3）；肺臟與胸腔明顯粘連，胸腔有大量黃色、發(fā)出臭味的渾濁積液。肺門淋巴結腫大，切面呈紫紅色；其他臟器組織病變不明顯。

3 實驗室診斷

3.1 培養(yǎng)基與試劑

8%綿羊鮮血瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍培養(yǎng)基（EMB）、SS瓊脂培養(yǎng)基（SS）、甘露醇高鹽培養(yǎng)基（MSA）、金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基（BPAB）、卵黃瓊脂培養(yǎng)基（EYAB）、哥倫比亞瓊脂（CNA）、BETA-SSA瓊脂培養(yǎng)基（SSA）等10種固體培養(yǎng)基，LIM液體培養(yǎng)基，支原體牛心湯復合培養(yǎng)基，配方為：牛心湯1 000 mL、蛋白胨10 g、氯化鈉5 mL、酵母提取液10 mL、無菌馬血清200 mL、1.25%醋酸鉈溶液20 mL、青霉素200 IU/mL 。平皿固體培養(yǎng)基購自青島海博生物技術有限公司；頭孢噻呋鈉、阿米卡星、四環(huán)素、氨芐西林、恩諾沙星、新霉素、卡那霉素、先鋒霉素Ⅳ、先鋒霉素Ⅵ、克百特、氧氟沙星、鏈霉素、慶大霉素等13種藥物的藥敏片購自杭州微生物試劑有限公司。結晶紫、碘液、95%無水乙醇、石碳酸復紅；營養(yǎng)肉湯，革蘭氏染色液，生理鹽水，藥敏紙片生化鑒定管等。

3.2 細菌的分離培養(yǎng)

無菌分別取2頭病牛的肺臟、肝臟、脾臟、淋巴結、氣管、關節(jié)液等臟器組織新鮮切面分別接種到8%綿羊鮮血瓊脂、EMB、SS、MSA、EYAB、CNA、SSA等固體培養(yǎng)基上，37 ℃18～24 h進行培養(yǎng)。其中在麥康凱培養(yǎng)基上呈現(xiàn)大量邊緣整齊或波狀、稍突起，表面光滑濕潤，直徑1.0～2.0 mm、粉紅色或深紅色的圓形菌落，在EMB培養(yǎng)基上呈紫黑色帶金屬光澤的圓形菌落[2]，在普通瓊脂平板上呈灰白色，直徑1.5～2.0 mm的圓形菌落。

3.3 支原體的分離培養(yǎng)

無菌采取肺、肝、脾、腎等組織臟器，直接剪成小塊放在固體培養(yǎng)基上劃一直線，再用無菌鉑耳環(huán)在與其垂直方向劃線[3]。固體瓊脂平板置37 ℃潮濕需氧條件或在5%二氧化碳下培養(yǎng)48～96 h，用斜射光或放大25～40倍的立體顯微鏡檢查，若有特異菌落出現(xiàn)，應選取散在的單個菌落用無菌解剖刀切下小瓊脂塊，用巴氏吸管小心地將菌落和周圍瓊脂吸入，再將其移入盛有2～3 mL的液體肉湯培養(yǎng)管培養(yǎng)48 h，將其培養(yǎng)物通過孔徑0.45 μL的濾膜過濾后作1：10和1：100稀釋，每一個稀釋液取0.05 mL涂布于瓊脂平板，即可得到純的支原體培養(yǎng)物。

3.4 形態(tài)與染色鏡檢

挑取典型單個菌落進行革蘭氏染色并逐一鏡檢，詳細記錄鏡檢結果。隨后分2次對典型菌落進行了再次傳代培養(yǎng)，獲得了純培養(yǎng)物。

3.5 生化鑒定

挑取典型菌落進行生化試驗，觀察并記錄詳細結果。

3.6 藥敏試驗

分別對2頭發(fā)病牛各臟器組織分離培養(yǎng)的細菌培養(yǎng)物進行紙片式藥敏試驗，共選取13種常用及廣譜抗菌藥敏片進行檢測。

4 結果與分析

4.1 鏡檢及生化試驗結果

細菌涂片染色檢查為革蘭氏陰性、大小一致的粉紅色的短小桿菌，初步鑒定為大腸桿菌。作生化試驗對分離菌進行鑒定，結果表明符合大腸桿菌的特征（見表1）。

4.2 支原體培養(yǎng)結果

在高血清量的復雜培養(yǎng)基上有細菌生長，在固體培養(yǎng)基上菌落呈油煎荷包蛋樣特征性外觀[4]，結果見圖4。

4.3 藥敏試驗結果

克百特、先鋒VI高敏，氧氟沙星、諾氟沙星、頭孢噻呋鈉、四環(huán)素中敏，其他藥物效果不明顯（表2）。

5 小結與討論

根據(jù)檢測法確定了在成年母牛和犢牛的肺臟、肺門淋巴結、氣管、關節(jié)液等組織中均檢測到了支原體和致病性大腸桿菌。該牛場成年母牛和犢牛所發(fā)病例均為支原體、致病性大腸桿菌混合感染所致的傳染性疾病。大腸桿菌和支原體都是條件性致病微生物。奶牛大腸桿菌性呼吸道炎癥是由于母牛的飼養(yǎng)管理不良或在產(chǎn)后機體抵抗力下降的情況下，致病性大腸桿菌侵入機體而引起呼吸異常或呼吸困難，引發(fā)早產(chǎn)，同時病牛發(fā)生關節(jié)炎，表現(xiàn)為關節(jié)腫大或積液[6]。犢牛感染后表現(xiàn)為纖維素性肺炎或支氣管肺炎[7]。支原體是我國奶牛和育肥牛新出現(xiàn)的一種致肺炎、繼發(fā)關節(jié)炎的病原因子[8]。該病原體于1961 年首次在美國患有乳房炎的病牛中分離出來[9]，1976 年被描述為致呼吸道疾病的病因[10]，目前在歐洲和北美洲流行并造成了嚴重的經(jīng)濟損失[11，12]。目前已被認為是育肥牛、青年奶牛與犢牛呼吸道疾病與多發(fā)性關節(jié)炎的重要病因。它不僅可以導致牛的急性呼吸系統(tǒng)疾病，還可以導致持續(xù)感染，以慢性支氣管肺炎伴有肺干酪樣或凝固性壞死病變?yōu)椴±硖卣鳎Ｅc細菌、病毒協(xié)同作用[13]。當牛場管理不善，如舍棚過度擁擠、通風不良、溫度太高等氣候因素將加劇病情，臨床上對多種抗生素的治療效果很差[14]。

綜上所述，當致病性大腸桿菌和支原體混合感染引起奶牛肺炎及關節(jié)炎時，為牛群類似病例的有效治療與防控帶來困難。從降低相關病例的發(fā)病率、病死率及減少損失等角度考慮，建議采取綜合性防控措施。如選擇有效藥物，最好是牛場先前并未使用但藥效同樣可靠的藥用于群體的平時藥物預防，配合有效的衛(wèi)生消毒工作及良好的飼養(yǎng)管理如防寒保暖，以有效防止此類病例的發(fā)生與流行。對病牛做到早發(fā)現(xiàn)、早隔離、早治療，尤其是要選擇藥敏試驗推薦的有效藥物，如克百特、先鋒霉素Ⅵ進行治療。

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