原位缺口末端標記法觀察加味青蒿鱉甲湯干預Lewis肺癌小鼠細胞凋亡的研究

藺禹帆，粟 栗

（長春中醫藥大學，長春 130117）

肺癌，即原發性支氣管癌，為起源于支氣管黏膜或腺體的惡性腫瘤[1]。有調查顯示，不論是在發達國家還是在發展中國家，肺癌的發病率均為惡性腫瘤發病率之首；并預測到2020年，在發展中國家中，肺癌的發病率仍排名第一位[2]。我國第三次死亡原因調查結果顯示，肺癌已成為我國癌癥死亡原因的首位，與上世紀70年代比較上升了465%[3]。雖然肺癌的治療技術日新月異，但5年生存率從4%僅上升至12%左右，現有的抗腫瘤藥物仍只能起到緩解病情作用，患者無進展生存期平均僅延長3個月～5個月。因此，對于肺癌的治療是醫學界共同面臨的難題。

青蒿鱉甲湯出自清代溫病學家吳鞠通所著的《溫病條辨》。根據臨床肺癌常見辨證分型進行加減化裁，組成加味青蒿鱉甲湯，在臨床應用中對于提高機體內在抗病能力來抑制腫瘤的生長、減少放化療所帶來的不良反應、控制癌性發熱等方面具有良好的療效。

本實驗采用原位末端標記法，研究加味青蒿鱉甲湯對Lewis肺癌小鼠腫瘤細胞凋亡的影響，通過對凋亡指數的分析，探討加味青蒿鱉甲湯干預腫瘤細胞凋亡的作用。

1 實驗材料

1.1 實驗細胞 Lewis 細胞株（Lewis Lung carcinoma，LLC），于中國科學院細胞庫購買。

1.2 實驗動物 健康C57BL/6小鼠（18 g±2 g）70只，SPF級，6周齡，雄性，于遼寧長生生物技術有限公司購買。符合國家標準固體混合飼料喂養，自由飲食及飲水。實驗室內光線充足，溫度與濕度適宜。實驗開始前適應性喂養一周。

1.3 受試藥物 加味青蒿鱉甲湯由青蒿、鱉甲、生地、知母、丹皮、黃芪、地龍、姜半夏、白花蛇舌草共9味中藥組成（長春中醫藥大學附屬醫院）；順鉑注射液：6 mL：30 mg（江蘇豪森藥業股份有限公司）。

1.4 試劑 1 640培養基（武漢Boster生物工程有限公司）；胎牛血清（美國gibco公司）；胰蛋白酶（武漢Boster生物工程有限公司）；二甲基亞砜（Biosharp生物科技）；青霉素和鏈霉素（山東魯抗）；TUNEL試劑盒（上海生工）；DAB顯色試劑盒（邁新試劑）；4%水合氯醛，福爾馬林，各個濃度乙醇，二甲苯等。

1.5 儀器 150i CO2恒溫細胞培養箱（美國Thermofisher公司）；超凈臺（美國Thermofisher公司）；DMI3000 倒置顯微鏡（德國Leica公司）；烘箱（美國Thermofisher公司）；SX-500高壓蒸汽滅菌鍋（TOMY公司）；石蠟切片機，組織自動包埋機等。其他：培養瓶、培養皿、離心管、血清瓶、微孔過濾膜、石蠟膜、恒溫水浴箱、離心機、醫用直尖眼科剪、醫用彎尖眼科剪、醫用止血鉗、直頭鑷子、彎頭鑷子，醫用紗布、醫用棉球、灌胃器、注射器、微量移液器、EP管若干等。

2 實驗方法

2.1 細胞培養 應用1640培養基、胎牛血清（FBS）、雙抗（青霉素+鏈霉素）配制全培養基，于二氧化碳恒溫培養箱中培養Lewis肺癌細胞。用倒置顯微鏡觀察Lewis肺癌細胞，細胞呈圓形或橢圓形并有部分細胞懸浮在培養基中。當細胞貼壁數量達培養瓶底壁的80%左右時，此時細胞生長狀態良好，可傳代、凍存。整個過程一定要嚴格遵守無菌操作。

2.2 荷瘤小鼠模型的制備 將細胞濃度調整到約4×107個/mL，用1 mL注射器每次抽取0.05 mL細胞懸液，接種于C57BL/6小鼠右腋后線處皮下。在接種過程中應不斷吹打細胞懸液，防止細胞沉降而造成接種細胞濃度不均，并盡量縮短造模時間。造模后，每天檢查小鼠接種部位。到造模第8天時，在小鼠接種部位可觸及米粒大小腫塊，表示造模成功。

2.3 實驗分組及給藥 選取造模成功 的小鼠，測量每只小鼠腫瘤的長軸（a）與短軸（b），按照v=ab2/2計算出每只小鼠腫瘤的體積。按照腫瘤體積的大小，將小鼠隨機分為模型組，加味青蒿鱉甲湯低劑量組、加味青蒿鱉甲湯中劑量組、加味青蒿鱉甲湯高劑量組、順鉑組，每組10只。造模第8天開始，模型組給予生理鹽水0.4 mL灌胃，1 d/次；加味青蒿鱉甲湯低、中、高劑量組分別按照1:2:4的比例給予中藥湯劑0.4 mL灌胃，1 d/次；順鉑組給予濃度為0.15 mg/mL的順鉑注射液0.2 mL腹腔注射，隔日1次。

2.4 取材 給藥第15天取材。取材前稱小鼠的體質量，按照0.1 mL/10 g的標準用4%的水合氯醛麻醉小鼠，眼球取血后，脫頸椎處死小鼠，剝離腫瘤。將腫瘤組織應用福爾馬林固定。

2.5 TUNEL法檢測 將用福爾馬林固定好的腫瘤組織，修整為大小約為0.3 mm×1.0 cm×1.0 cm的組織塊，放入脫水盒中，用自來水沖洗去福爾馬林固定液。常規脫水、石蠟包埋，連續切片，片厚3 μm。采用TUNEL 原位細胞凋亡檢測試劑盒（POD），按說明書操作。光學顯微鏡下觀察組織細胞染色情況。

2.6 統計方法 應用SPSS 19.0，采用單因素方差分析分析處理。

3 實驗結果

脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的原位缺口末端標記法（TUNEL），對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色，細胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細胞，即凋亡的細胞。細胞核呈藍色者為蘇木精復染的陰性細胞，即腫瘤細胞。模型組內僅見個別凋亡細胞；低劑量組有少量的凋亡細胞；中劑量組可見凋亡細胞；高劑量，順鉑組可見大量凋亡細胞。（見圖1）

圖1 加味青蒿鱉甲湯對Lewis肺癌小鼠細胞凋亡的影響

每張切片選取5個高倍鏡（10×40）視野，按照“每張切片至少計數500個細胞，計算每100個細胞內的陽性細胞數，以百分數表示（%）計算細胞凋亡指數。與模型組相比較，各用藥組的凋亡指數明顯升高（P＜0.01），有統計學意義。順鉑組的凋亡指數高于中藥各組，有統計學意義。詳見表1。

表1 加味青蒿鱉甲湯對細胞凋亡指數的影響（±s）

表1 加味青蒿鱉甲湯對細胞凋亡指數的影響（±s）

注：與模型組比較，# P＜0.01；與順鉑組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組 別 數量/只 細胞凋亡指數/%模型組 8 7.59±2.04中藥低劑量組 9 26.68±2.96#△△中藥中劑量組 9 31.38±4.72#△△中藥高劑量組 9 38.71±3.81#△順鉑組 7 51.07±5.67#

4 討論

對于多細胞生物而言，為了維持機體的正常代謝過程和內環境的穩定，會有大量“多余的”或“生病的”細胞以死亡的方式被處理掉，1972年，病理學家Kerr等人將自然細胞死亡過程定義為凋亡[5]34。細胞凋亡是一個程序化的過程，這一程序早已預設于活細胞之中，當細胞受到來自細胞內外的凋亡誘導因素作用的時候，這一程序啟動，并由嚴格和復雜的信號網絡調控而發生自主性細胞有序死亡過程[5]，34.50%以上的腫瘤細胞在凋亡機制上存在缺陷，凋亡異常直接導致本該死亡的細胞被保留下來，其中有些突變的細胞增殖失控，從而形成腫瘤[6]。

細胞凋亡過程中有一系列特征性的形態學、生物化學、細胞學及分子生物學的改變，其中，最重要和最具特征性的改變是Ca2+/Mg2+依賴性的核酸內切酶的激活導致染色質DNA在核小體連接部位斷裂，形成以180～200 bp為最小單位的單體或寡聚體片段[7]177。脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的原位缺口末端標記法（TUNEL）是分子生物學與形態學相結合的研究方法，于1992年由Gavricli等首先報道[7]188。本實驗應用的TUNEL法，采用蛋白酶K消化法對標本細胞打孔，后將標本與末端轉移酶（TdT）和過氧化酶標記的脫氧核苷酸（dUTP）一起溫育，在溫育過程中，TdT將標記的dUTP連接到DNA片段的自由3’-末端上，DAB顯色后，在光學顯微鏡下進行觀察[7]179。

在臨床應用中，青蒿鱉甲湯加味主要針對癌性發熱、放化療后體虛以及癌轉移等癥狀。目前認為癌性發熱主要與腫瘤壞死組織的吸收、腫瘤的某些代謝產物致熱原、腫瘤組織釋放前列腺素 E、器官代謝失常及腫瘤組織自身存在炎癥有關[8]。臨床上治療癌性發熱多以物理降溫或使用非甾體類消炎鎮痛藥、糖皮質激素等對癥治療為主，故而中醫治療具有一定的優勢。周軍等[9]運用青蒿鱉甲湯加減治療癌性發熱54例，其中顯效30例、有效16例、無效8例，有效率為85%。司瑞超[10]、董方[11]、任惠芳等[12]臨床醫生應用青蒿鱉甲湯加減治療癌性發熱，并與吲哚美辛栓、消炎痛栓、痰熱清、塞來昔布等臨床常用藥比較后，認為青蒿鱉甲湯加減治療癌性發熱具有良好的療效。另外，臧凱[13]、王蓉等[14]、李麗[10]通過臨床觀察，認為青蒿鱉甲湯加減對于改善放化療所帶來的不良反應，提高生活質量以及抑制轉移等方面具有良好效果。本實驗結果從形態學上證實，加味青蒿鱉甲湯具有誘導小鼠Lewis肺癌細胞凋亡的作用，也進一步闡明了，其可以通過促進腫瘤細胞凋亡來達到抑制腫瘤細胞的目的。表明加味青蒿鱉甲湯對于肺癌的療效，可兼顧臨床表現以及腫瘤本身，達到標本兼治的目的。