宮頸癌宮頸活檢組織DAPK1基因啟動子甲基化的臨床意義

[摘要] 目的 研究宮頸活檢組織DAPK1基因甲基化在宮頸癌中的臨床意義。 方法 采用甲基化特異性PCR檢測宮頸癌患者和正常女性宮頸活檢組織DAPK1基因啟動子甲基化，比較其差異并分析宮頸癌患者宮頸活檢組織DAPK1基因啟動子甲基化與臨床病理因素的關系。 結果 宮頸癌患者宮頸活檢組織DAPK1基因啟動子甲基化率顯著高于正常女性（P < 0.05）。宮頸癌患者宮頸活檢組織DAPK1基因啟動子甲基化率在年齡、吸煙史、酗酒史和病理類型無明顯差異（P > 0.05），在HPV感染、分化程度、腫瘤直徑、淋巴結轉移、遠處轉移和Figo分期中的差異具有統計學意義（P < 0.05）。 結論 宮頸癌患者宮頸活檢組織DAPK1基因啟動子甲基化率顯著高于正常人，與病情及預后密切相關。

[關鍵詞] 宮頸癌；DAPK1；甲基化

[中圖分類號] R737.33 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2013）35-0016-02

研究發現宮頸癌的發生發展與基因表達異常有關，其中基因甲基化導致基因表達下降是目前發現的基因突變外最重要發病機制[1]。死亡相關蛋白激酶1（death-associated protein kinase 1，DAPK1）為新近發現的抑癌基因，在腫瘤的發病機制中扮演重要角色，在多種腫瘤中可檢測到其甲基化抑制基因表達狀態[2，3]。本研究采用甲基化特異性PCR檢測宮頸癌患者和正常人DAPK1基因啟動子甲基化，研究DAPK1基因啟動子甲基化在宮頸癌中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選擇2010年1月～2013年6月初治宮頸癌患者為研究目標，經臨床表現、癥狀體征、影像學、細胞學和（或）病理組織學確診為宮頸癌。本組研究對象包括80例宮頸癌患者，年齡32～78歲，平均（51.3±12.7）歲。另以同期健康體檢的50例正常女性為對照，年齡30～80歲，平均（51.5±13.3）歲。兩組研究對象在年齡等方面的差異無統計學意義（P > 0.05）。

1.2 材料與試劑

所有研究對象宮頸取活檢組織后立即提取基因組DNA，根據基因組DNA提取試劑盒操作說明進行，提取的DNA立即行甲基化檢測或-20℃保存待檢。

1.3 DAPK1基因啟動子甲基化檢測

采用甲基化特異性PCR檢測DAPK1基因啟動子甲基化。將提取的基因組DNA行重硫酸鹽轉化。引物采用在線引物設計軟件Methprimer（http：//www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi）設計。轉化后的產物行PCR擴增，PCR序列見表1，反應條件為95℃預變性12 min，95℃變性1 min，65℃退火45 s，72℃延伸45 s，共32個循環，最后一輪72℃延伸10 min。

1.4 統計學分析

統計學分析采用SPSS 11.5統計學軟件。基因啟動子甲基化與臨床病理因素的關系比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法計算P值，P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

47例宮頸癌患者活檢組織檢測到DAPK1基因啟動子甲基化，甲基化率為58.8%，正常女性中2例檢測到DAPK1基因啟動子呈甲基化，甲基化率為4.0%，宮頸癌患者宮頸活檢組織DAPK1基因啟動子甲基化率顯著高于正常女性（P < 0.05）。宮頸癌患者DAPK1基因啟動子甲基化率在年齡、吸煙史、酗酒史和病理類型方面無明顯差異（P > 0.05），在HPV感染、分化程度、腫瘤直徑、淋巴結轉移、遠處轉移和Figo分期中的差異有統計學意義（P < 0.05）。見表2。

表2 不同臨床病理因素宮頸活檢組織DAPK1基因啟動子甲基化的差異

3 討論

DNA甲基化是表觀遺傳學最主要的調控基因表達方式，甲基化可導致染色質空間結構發生改變，甲基化CG或結合甲基結合蛋白后可阻遏轉錄因子結合到轉錄起始點，導致基因無法復制而抑制基因表達，因真核生物的CpG島主要分布于啟動子區域，故目前研究DNA甲基化主要集中在基因啟動子[4，5]。越來越多的研究證實，基因啟動子甲基化導致基因表達下降，其甲基化率與腫瘤的病情及預后密切相關，較傳統的蛋白質水平的標志物具有更高的靈敏度和特異性[6]。DAPK1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是新近發現的抑癌基因，可調控細胞周期，可促進正常細胞發生凋亡，與腫瘤的發生、發展緊密相關[7]。目前研究發現，DAPK1基因啟動子甲基化在消化道腫瘤、呼吸系統腫瘤等眾多腫瘤中處于高甲基化、表達缺失狀態，且其甲基化與病情及預后相關，甲基化率越高意味著腫瘤患者病情越重、預后越差[8]。我們的研究發現，宮頸癌患者DAPK1基因啟動子甲基化發生率顯著高于正常女性，證實與其他腫瘤類似，宮頸癌患者存在DAPK1基因啟動子高甲基化狀態。

在本研究中，腫瘤分化程度低、腫瘤直徑大、有淋巴結轉移、遠處轉移及分期晚的患者宮頸活檢組織DAPK1基因啟動子甲基化率顯著高于分化程度高、腫瘤直徑小、無淋巴結轉移、無遠處轉移及分期早的宮頸癌患者，這些數據均表明DAPK1基因啟動子甲基化在宮頸癌病情及預后中具有一定價值。有研究表明DAPK1基因甲基化與HPV感染密切相關，花敏慧等[9]研究證實DAPK1甲基化是宮頸癌發生的早期事件，且其與高危型HPV感染呈正相關。基于腫瘤的分化程度和臨床分期與宮頸癌病情及預后密切相關這一事實，推測DAPK1基因啟動子甲基化可作為宮頸癌基因層次的標志物，可能在宮頸癌的診斷、病情與預后評估中扮演重要角色。此外，DAPK1基因啟動子甲基化或許能反應HPV感染，尤其在無法直接取得HPV感染證據下檢測基因水平的DAPK1基因啟動子甲基化有利于對HPV治療做出評價。值得一提的是，目前尚無DAPK1與宮頸癌的相關研究，本研究僅僅在臨床病理因素方面發現DAPK1與宮頸癌的關系，其具體作用機制有待于進一步研究。

[參考文獻]

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（收稿日期：2013-10-17）