山楂葉總黃酮對糖尿病大鼠心肌中HO—1/CO系統和iNOS/NO系統影響的研究

[摘要] 目的 探討山楂葉總黃酮對糖尿病大鼠心肌中HO-1/CO系統和iNOS/NO系統的影響。 方法 將8周齡SD雄性大鼠40只隨機分為Ⅰ組（山楂葉總黃酮治療組）和Ⅱ組（糖尿病組）各20只，觀察比較兩組糖尿病大鼠心肌組織中iNOS、NO、HO-1、CO的變化情況。 結果 實驗結束時測定大鼠心肌組織中HO-1活性和iNOS活性，山楂葉總黃酮治療組心肌組織中HO-1活性、iNOS活性均低于糖尿病組（P < 0.01），實驗結束時測定大鼠血清中CO和NO含量，山楂葉總黃酮治療組血清中CO、NO含量均分別明顯低于糖尿病組（P < 0.05）。結論 山楂葉總黃酮通過清除糖尿病大鼠心肌中自由基等抗氧化機制起到保護糖尿病大鼠心肌的作用。

[關鍵詞] 糖尿病性心肌病；山楂葉；總黃酮；HO-1/CO系統；iNOS/NO系統

[中圖分類號] R285 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）16-0008-02

糖尿病性心肌?。╠iabetic cardiomyopathy，DCM）的發病機制尚未完全闡明，眾多學者提出“氧化應激學說”，該學說認為糖尿病并發癥的出現可能是由氧化應激導致線粒體的電子傳遞鏈過氧化物產生過量所引起[1]。血紅素氧合酶（heme oxygenase，HO）是機體參與亞鐵血紅素代謝的一種多功能的微粒體氧化酶，可被降解生成膽綠素、一氧化碳（CO）和亞鐵離子，在氧化應激過程中具有重要的細胞保護作用。HO分為誘生型（HO-1）、結構型（HO-2）和最近才發現的血紅素氧合酶-3三種類型。HO-1也叫做熱休克蛋白，是目前發現的最易受誘導的抗氧化應激的酶。HO-1具有抗氧化、抗炎、抗血小板凝集、細胞保護和調節血管張力等許多重要生物學作用[2]。一氧化氮（NO）是一氧化氮合酶（NOS）催化L-精氨酸（L-Arg）生成的產物，NOS 分為 3 種類型：Ⅰ型 NOS（nNOS）、Ⅱ型NOS（eNOS）、Ⅲ型NOS（iNOS）。nNOS 和 eNOS 合稱結構型，iNOS為誘導型。研究報道，NOS/NO系統不僅可以激活HO/CO系統，還對其有抑制作用，而HO/CO系統對NOS/NO系統也有反饋抑制作用[3]。山楂葉是薔薇科山楂屬植物的葉子，其主要化學成分是總黃酮。山楂葉總黃酮具有抗動脈粥樣硬化、抗氧化、降血糖及抗血小板凝聚的作用，尤其具有提高組織中抗氧化酶活性、抑制自由基損傷、防止脂質過氧化的抗氧化作用[4]。本研究旨在探討山楂葉總黃酮對糖尿病大鼠心肌中HO-1/CO系統和iNOS/NO系統的影響，從而為進一步深層次的研究DCM的發病機制指明了新的方向。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級雄性SD大鼠40只，體重（180±20） g（由佳木斯大學實驗動物中心提供）。STZ由美國Sigma公司生產。將SD大鼠隨機分成兩組，即Ⅰ組（山楂葉總黃酮治療組）和Ⅱ組（糖尿病組），每組20只。

1.2 實驗方法

在大鼠適應期后給予高糖高脂飼料（在標準全價混合飼料的基礎上添加蔗糖、煉豬油和蛋黃，熱能含量21.6 kJ/kg）。喂養4周后腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）（臨用前溶解在pH=4.0的0.1 mmol/L檸檬酸緩沖液內，25 mg/kg，每日1次，連續2 d）。注射藥物2 d后間隔1 d應用血糖測試儀測查大鼠空腹血糖（測試前禁食12 h），以血糖含量16.7 mmol/L為2型糖尿病大鼠模型判定標準。Ⅰ組予注射用山楂葉總黃酮（益心酮注射液，由長春三九生物制藥提供），每天腹腔注射山楂葉總黃酮注射液（30 mg/kg）1次，連續給藥4周；Ⅱ組則給予腹腔注射生理鹽水，同樣連續4周。

1.3 檢測方法

1.3.1 HO-1的測定 參照Morita等[5]的方法并稍作改良。在紫外分光光度計上測定膽紅素的生成量即可反映HO的活性。

1.3.2 CO的測定 應用721A型分光光度計測OD541和 OD555，根據文獻報道的CO含量的計算公式計算。

1.3.3 NOS活性測定 采用3H精氨酸轉化生成3H胍氨酸測定法。

1.3.4 血清NO微量測定 參照文獻[6，7]進行，用酶標儀在570 nm處讀取光密度，同時以亞硝酸鹽作標準曲線，結果以NO轉變為亞硝酸鹽表示。

1.4 觀察指標

觀察比較兩組糖尿病大鼠心肌組織中HO-1、CO、iNOS、NO的變化情況。

1.5 統計學方法

結果以均數±標準差（x±s）表示，組間差異采用t檢驗，使用的統計學軟件為SPSS 18.0軟件，P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1大鼠心肌組織細胞中HO-1和iNOS含量變化

實驗結束時測定大鼠心肌組織中HO-1活性和iNOS活性，山楂葉總黃酮治療組心肌組織中HO-1活性、iNOS活性均低于糖尿病組，差異有高度統計學意義（P < 0.01）（表1）。

2.2 大鼠血清中NO和CO含量變化

實驗結束時測定大鼠血清中CO和NO含量，山楂葉總黃酮治療組血清中CO、NO含量均分別明顯低于糖尿病組，差異有統計學意義（P < 0.05）（表2）。

3 討論

研究表明，糖尿病心肌纖維化與氧化應激之間的關系密切，氧化應激可與糖基化終末產物（AGEs）相互作用而加重心肌纖維化。因此，尋求有效地降低機體氧化應激水平、保護患有糖尿病的心肌組織的藥物治療至關重要。

HO/CO和NOS/NO系統在抗氧化應激方面顯示出互補及代償性調節作用。HO-1是目前發現的受最多因素誘導的應激蛋白，誘導HO-1使其高表達是氧化應激的一種普遍標志[6]。HO-1可以將血紅素降解成為膽紅素與膽綠素，二者均為抗氧化劑，均可清除有機體內的氧自由基；同時HO-1能增加鐵蛋白結合游離鐵，降低體內游離鐵的濃度從而發揮其抗氧化作用[7]。本實驗研究顯示，山楂葉總黃酮（HLF）治療組大鼠心肌中HO-1、CO含量明顯低于糖尿病組，說明山楂葉總黃酮具有降低氧化應激對HO-1的誘導并使HO-1含量降低的作用，同時亦證實HO-1的誘導已成為氧化應激的一種普遍標志。DCM時，iNOS 的表達或活性下降，導致內皮源性NO產生減少，而平滑肌細胞表達的iNOS的活性增加會產生大量NO自由基，刺激細胞凋亡和膠原組織的降解而促進DCM的形成[8]。本研究發現，山楂葉總黃酮（HLF）治療組大鼠心肌中iNOS、NO含量明顯低于糖尿病組，說明山楂葉總黃酮可以減少對iNOS的誘導，使iNOS源性NO生成量大大降低，從而減輕心肌細胞的損害，減少組織損傷。且有研究報道，在動脈粥樣硬化形成中HO-1的活性及CO的產生增加，一方面能增加 cGMP舒張血管，補償cNOS源性NO的生成不足；而另一方面，HO/CO 系統還可以抑制iNOS的活性，減少iNOS源性NO的生成量，從而減少組織損傷[9]。且研究證實，山楂葉總黃酮對心血管系統有著明顯的藥理作用，如冠狀動脈擴張、降血脂、降血壓、降血糖、抗氧化、抗血小板聚集和強心等，其作用機制主要為通過增強內源性氧自由基清除系統的能力，減輕脂質過氧化反應及其有害代謝產物對心肌細胞膜的損害而發揮作用的[10]。

綜上，山楂葉總黃酮通過清除糖尿病大鼠心肌中自由基等抗氧化機制起到保護糖尿病大鼠心肌的作用。

[參考文獻]

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[3] 楊宇杰. 山楂葉總黃酮對高脂血癥大鼠血管功能損傷的保護作用[J].中草藥，2007，38（11）：1687.

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[9] 楊宇杰. 山楂葉總黃酮對高脂血癥大鼠血管功能損傷的保護作用[J].中草藥，2007，38（11）：1687.

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（收稿日期：2013-04-18）