山楂葉總黃酮對(duì)糖尿病大鼠心肌中HO—1/CO系統(tǒng)和iNOS/NO系統(tǒng)影響的研究

[摘要] 目的 探討山楂葉總黃酮對(duì)糖尿病大鼠心肌中HO-1/CO系統(tǒng)和iNOS/NO系統(tǒng)的影響。 方法 將8周齡SD雄性大鼠40只隨機(jī)分為Ⅰ組（山楂葉總黃酮治療組）和Ⅱ組（糖尿病組）各20只，觀察比較兩組糖尿病大鼠心肌組織中iNOS、NO、HO-1、CO的變化情況。 結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)測(cè)定大鼠心肌組織中HO-1活性和iNOS活性，山楂葉總黃酮治療組心肌組織中HO-1活性、iNOS活性均低于糖尿病組（P < 0.01），實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)測(cè)定大鼠血清中CO和NO含量，山楂葉總黃酮治療組血清中CO、NO含量均分別明顯低于糖尿病組（P < 0.05）。結(jié)論 山楂葉總黃酮通過(guò)清除糖尿病大鼠心肌中自由基等抗氧化機(jī)制起到保護(hù)糖尿病大鼠心肌的作用。

[關(guān)鍵詞] 糖尿病性心肌??；山楂葉；總黃酮；HO-1/CO系統(tǒng)；iNOS/NO系統(tǒng)

[中圖分類號(hào)] R285 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2013）16-0008-02

糖尿病性心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，眾多學(xué)者提出“氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)”，該學(xué)說(shuō)認(rèn)為糖尿病并發(fā)癥的出現(xiàn)可能是由氧化應(yīng)激導(dǎo)致線粒體的電子傳遞鏈過(guò)氧化物產(chǎn)生過(guò)量所引起[1]。血紅素氧合酶（heme oxygenase，HO）是機(jī)體參與亞鐵血紅素代謝的一種多功能的微粒體氧化酶，可被降解生成膽綠素、一氧化碳（CO）和亞鐵離子，在氧化應(yīng)激過(guò)程中具有重要的細(xì)胞保護(hù)作用。HO分為誘生型（HO-1）、結(jié)構(gòu)型（HO-2）和最近才發(fā)現(xiàn)的血紅素氧合酶-3三種類型。HO-1也叫做熱休克蛋白，是目前發(fā)現(xiàn)的最易受誘導(dǎo)的抗氧化應(yīng)激的酶。HO-1具有抗氧化、抗炎、抗血小板凝集、細(xì)胞保護(hù)和調(diào)節(jié)血管張力等許多重要生物學(xué)作用[2]。一氧化氮（NO）是一氧化氮合酶（NOS）催化L-精氨酸（L-Arg）生成的產(chǎn)物，NOS 分為 3 種類型：Ⅰ型 NOS（nNOS）、Ⅱ型NOS（eNOS）、Ⅲ型NOS（iNOS）。nNOS 和 eNOS 合稱結(jié)構(gòu)型，iNOS為誘導(dǎo)型。研究報(bào)道，NOS/NO系統(tǒng)不僅可以激活HO/CO系統(tǒng)，還對(duì)其有抑制作用，而HO/CO系統(tǒng)對(duì)NOS/NO系統(tǒng)也有反饋抑制作用[3]。山楂葉是薔薇科山楂屬植物的葉子，其主要化學(xué)成分是總黃酮。山楂葉總黃酮具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗氧化、降血糖及抗血小板凝聚的作用，尤其具有提高組織中抗氧化酶活性、抑制自由基損傷、防止脂質(zhì)過(guò)氧化的抗氧化作用[4]。本研究旨在探討山楂葉總黃酮對(duì)糖尿病大鼠心肌中HO-1/CO系統(tǒng)和iNOS/NO系統(tǒng)的影響，從而為進(jìn)一步深層次的研究DCM的發(fā)病機(jī)制指明了新的方向。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雄性SD大鼠40只，體重（180±20） g（由佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。STZ由美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)。將SD大鼠隨機(jī)分成兩組，即Ⅰ組（山楂葉總黃酮治療組）和Ⅱ組（糖尿病組），每組20只。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

在大鼠適應(yīng)期后給予高糖高脂飼料（在標(biāo)準(zhǔn)全價(jià)混合飼料的基礎(chǔ)上添加蔗糖、煉豬油和蛋黃，熱能含量21.6 kJ/kg）。喂養(yǎng)4周后腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）（臨用前溶解在pH=4.0的0.1 mmol/L檸檬酸緩沖液內(nèi)，25 mg/kg，每日1次，連續(xù)2 d）。注射藥物2 d后間隔1 d應(yīng)用血糖測(cè)試儀測(cè)查大鼠空腹血糖（測(cè)試前禁食12 h），以血糖含量16.7 mmol/L為2型糖尿病大鼠模型判定標(biāo)準(zhǔn)。Ⅰ組予注射用山楂葉總黃酮（益心酮注射液，由長(zhǎng)春三九生物制藥提供），每天腹腔注射山楂葉總黃酮注射液（30 mg/kg）1次，連續(xù)給藥4周；Ⅱ組則給予腹腔注射生理鹽水，同樣連續(xù)4周。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 HO-1的測(cè)定 參照Morita等[5]的方法并稍作改良。在紫外分光光度計(jì)上測(cè)定膽紅素的生成量即可反映HO的活性。

1.3.2 CO的測(cè)定 應(yīng)用721A型分光光度計(jì)測(cè)OD541和 OD555，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的CO含量的計(jì)算公式計(jì)算。

1.3.3 NOS活性測(cè)定 采用3H精氨酸轉(zhuǎn)化生成3H胍氨酸測(cè)定法。

1.3.4 血清NO微量測(cè)定 參照文獻(xiàn)[6，7]進(jìn)行，用酶標(biāo)儀在570 nm處讀取光密度，同時(shí)以亞硝酸鹽作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果以NO轉(zhuǎn)變?yōu)閬喯跛猁}表示。

1.4 觀察指標(biāo)

觀察比較兩組糖尿病大鼠心肌組織中HO-1、CO、iNOS、NO的變化情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間差異采用t檢驗(yàn)，使用的統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件為SPSS 18.0軟件，P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1大鼠心肌組織細(xì)胞中HO-1和iNOS含量變化

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)測(cè)定大鼠心肌組織中HO-1活性和iNOS活性，山楂葉總黃酮治療組心肌組織中HO-1活性、iNOS活性均低于糖尿病組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）（表1）。

2.2 大鼠血清中NO和CO含量變化

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)測(cè)定大鼠血清中CO和NO含量，山楂葉總黃酮治療組血清中CO、NO含量均分別明顯低于糖尿病組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）（表2）。

3 討論

研究表明，糖尿病心肌纖維化與氧化應(yīng)激之間的關(guān)系密切，氧化應(yīng)激可與糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）相互作用而加重心肌纖維化。因此，尋求有效地降低機(jī)體氧化應(yīng)激水平、保護(hù)患有糖尿病的心肌組織的藥物治療至關(guān)重要。

HO/CO和NOS/NO系統(tǒng)在抗氧化應(yīng)激方面顯示出互補(bǔ)及代償性調(diào)節(jié)作用。HO-1是目前發(fā)現(xiàn)的受最多因素誘導(dǎo)的應(yīng)激蛋白，誘導(dǎo)HO-1使其高表達(dá)是氧化應(yīng)激的一種普遍標(biāo)志[6]。HO-1可以將血紅素降解成為膽紅素與膽綠素，二者均為抗氧化劑，均可清除有機(jī)體內(nèi)的氧自由基；同時(shí)HO-1能增加鐵蛋白結(jié)合游離鐵，降低體內(nèi)游離鐵的濃度從而發(fā)揮其抗氧化作用[7]。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，山楂葉總黃酮（HLF）治療組大鼠心肌中HO-1、CO含量明顯低于糖尿病組，說(shuō)明山楂葉總黃酮具有降低氧化應(yīng)激對(duì)HO-1的誘導(dǎo)并使HO-1含量降低的作用，同時(shí)亦證實(shí)HO-1的誘導(dǎo)已成為氧化應(yīng)激的一種普遍標(biāo)志。DCM時(shí)，iNOS 的表達(dá)或活性下降，導(dǎo)致內(nèi)皮源性NO產(chǎn)生減少，而平滑肌細(xì)胞表達(dá)的iNOS的活性增加會(huì)產(chǎn)生大量NO自由基，刺激細(xì)胞凋亡和膠原組織的降解而促進(jìn)DCM的形成[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，山楂葉總黃酮（HLF）治療組大鼠心肌中iNOS、NO含量明顯低于糖尿病組，說(shuō)明山楂葉總黃酮可以減少對(duì)iNOS的誘導(dǎo)，使iNOS源性NO生成量大大降低，從而減輕心肌細(xì)胞的損害，減少組織損傷。且有研究報(bào)道，在動(dòng)脈粥樣硬化形成中HO-1的活性及CO的產(chǎn)生增加，一方面能增加 cGMP舒張血管，補(bǔ)償cNOS源性NO的生成不足；而另一方面，HO/CO 系統(tǒng)還可以抑制iNOS的活性，減少iNOS源性NO的生成量，從而減少組織損傷[9]。且研究證實(shí)，山楂葉總黃酮對(duì)心血管系統(tǒng)有著明顯的藥理作用，如冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張、降血脂、降血壓、降血糖、抗氧化、抗血小板聚集和強(qiáng)心等，其作用機(jī)制主要為通過(guò)增強(qiáng)內(nèi)源性氧自由基清除系統(tǒng)的能力，減輕脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)及其有害代謝產(chǎn)物對(duì)心肌細(xì)胞膜的損害而發(fā)揮作用的[10]。

綜上，山楂葉總黃酮通過(guò)清除糖尿病大鼠心肌中自由基等抗氧化機(jī)制起到保護(hù)糖尿病大鼠心肌的作用。

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（收稿日期：2013-04-18）