人參皂苷Rh2的C—20構型確證

[摘要] 目的 確證人參次苷H主成分人參皂苷Rh2的結構與空間構型。 方法 單晶X-射線衍射，HPLC、13C-NMR比較與其C-20的R型異構體的差異。 結果 HPLC保留時間顯示人參皂苷H中主成分人參皂苷Rh2與酸降解R型異構體不同，二者是兩種不同成分；13C-NMR數據與文獻報道的20（S）-人參皂苷Rh2一致。單晶X-射線衍射結構分析也證實其為20（S）人參皂苷Rh2。 結論 人參次苷H主成分為20（S）-人參皂苷Rh2。

[關鍵詞] 20（S）-人參皂苷Rh2；差向異構體；單晶X-射線衍射

[中圖分類號] R285 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2013）14-0050-03

人參次苷H是以西洋參葉為起始原料經提取、堿降解、色譜分離提純后得到的一組富含次級人參皂苷Rh2、Rh1和Rk2的原料藥，其主要成分是20（S）人參皂苷Rh2，用于腫瘤治療。人參皂苷Rh2 的C-20存在R、S型兩種差向異構，抗腫瘤作用S型強于R型，具有構效效應[1-4]。西洋參莖葉中含有的達瑪烷型皂苷其天然結構絕大多數為20（S）構型，如果用鹽酸等強酸水解，C-20上的甲基和羥基發生差向異構，轉變為20（R）型。如果用堿水解，則保持20（S）構型不變[5]。我們已完成了西洋參莖葉為起始原料制備西洋參總皂苷，再經堿降解的半合成衍生化大規模制備人參次苷H原料工藝，因為采用堿降解法，理論上其主成分人參皂苷Rh2應該是20（S）構型。

從人參次苷H原料中分離得到人參皂苷Rh2的單體后，對其理化性質進行檢查，熔點218～220℃，難溶于水，微溶于乙酸乙酯、三氯甲烷，可溶于乙醇、甲醇；Molish反應呈陽性[6]；比旋度為[α]22D。24.8（c 0.9，MeOH）。還采用UV、IR、MS、1H-和13C-NMR等譜學分析方法對其結構進行了鑒定，與文獻報道的20（S）-人參皂苷Rh2一致。為進一步佐證對其C-20化學構型的推論，我們對獲得的人參皂苷Rh2進行了單晶培養，通過X-射線衍射分析，最終確定了其化學結構。

1材料與方法

1.1儀器與材料

西洋參總皂苷、人參次苷H、人參皂苷Rh2對照品，山東綠葉制藥有限公司自制；水（H2O）為山東綠葉制藥有限公司所制純化水；甲醇（MeOH）、硫酸、乙酸乙酯（EtOAc）、磷酸、三氯甲烷（CHCl3）、95%乙醇、無水乙醇（EtOH）等均為分析純；乙腈為色譜純；色譜硅膠（200-300目、100-200目，煙臺化工研究所）。單晶X-射線衍射儀：日本MAC DIP-2030K； Agilent1100高效液相色譜（HPLC）系統，discovery C18柱；Unity-Plus 400型NMR儀（美國瓦里安公司）。

1.2 方法

1.2.1 人參次苷H主成分的分離及單晶培養 人參次苷H原料經硅膠柱色譜分離，MeOH-H2O（4：1）重結晶，得白色針狀結晶。取白色針狀結晶用適量MeOH加熱溶解，再加入適量CHCl3、H2O，室溫下放置，使其緩緩長出單晶，單晶呈無色透明塊狀。

1.2.2 制備人參次苷H主成分的C-20差向異構體 取西洋參莖葉總皂苷40 g溶于1 000 mL 95% EtOH水溶液中，加入10%濃硫酸水溶液1 000 mL，80℃加熱降解4 h。降解液冷卻至室溫后用2 mol/L氫氧化鈉溶液調節pH 7，減壓蒸出EtOH，過濾得白色沉淀。酸降解物經硅膠柱色譜，EtOAc：EtOH=9：1洗脫，晶體再用MeOH-H2O（4：1）重結晶，得白色針狀結晶。

1.2.3 HPLC分析 精密稱取主成分與酸降解物樣品，50%乙腈溶解，稀釋至刻度，搖勻。分別量取此2個組份液體供試品及其它們的等體積混合樣20 μL，注入HPLC儀，固定相為十八烷基硅烷鍵和硅膠；流動相為乙腈-水-磷酸（65：35：0.125，v/v/v），檢測波長203 nm，流速1 mL/min。比較兩個組份HPLC圖譜的保留時間。

1.2.4 13C-NMR分析 主成分與其差向異構體樣品分別進行13C-NMR分析，溶劑為氘代吡啶（C5D5N）。

1.2.5 單晶結構測定 （1）衍射實驗：衍射用主成分晶體樣品呈無色透明塊狀，大小為0.12×0.15×0.15 mm，屬正交晶系，空間點群P212121，晶胞參數：a=10.775（1），b=12.008（1），c=33.360（1）■。晶胞體積V=4316.3（6）■3，晶胞內分子數Z=4。用MAC DIP-2030面探測儀收集衍射強度數據，Mokα輻射掃描，石墨單色器，晶體與IP板距離d=100 mm，管壓50 KV，管流70 mA，ω掃描，最大2θ角為50.0°，掃描范圍0～180°，回擺角為3°，掃描速度1.2°/min，每個畫面掃描2次，共計攝取60幅圖像，獨立衍射點為4674個，可觀察點（|F|2≥3σ|F|2）為3753個。

（2）結構計算：在微機上用直接法（shelxs86）解析晶體結構，獲得32個非氫原子位置。交迭使用最小二乘法和差值Fourier法獲得其他非氫原子位置，最小二乘法修正結構參數和判別原子種類，幾何計算法和差值Fourier法獲得全部氫原子位置，最終可靠因子Rf=0.068，Rw=0.067（w=1/σ|F|2）。

3 分析與討論

3.1 HPLC分析

從人參次苷H中分離得到的主成分保留時間為11.84 min；酸降解西洋參總皂苷得到的差向異構體保留時間為12.64 min；此外，混合樣中二個峰的分離度好，保留時間與單獨進樣一致，說明的確是2個不同的化合物。

3.2 13C-NMR譜數據對20位碳S構型推定

將主成分的13C-NMR譜從C-1→ C-30的化學位移數據與文獻報道[8]的20（S）-原人參二醇[20（S）-PPD）]比較，除了C-3的信號δ 88.8明顯向低場位移約10 ppm外，其他信號基本一致；而δ 88.8信號正是文獻報道[9]20（S）-PPD的C-3成苷后的苷化位移信號，說明主成分化合物是糖基與苷元結構相同的20（S）型PPD在C-3上成苷而得。

比較主成分化合物與其酸降解差向異構體樣品的13C-NMR數據，可以看出C-17，C-21，C-22上各自的化學位移之差（δ酸降解物-δ主成分）分別為-4.1 ppm，-4.1 ppm和8.1 ppm，符合藤榮偉[10]報道Tanaka總結的原人參二醇型皂苷C-20差向異構體13C-NMR化學位移規律，證明了它們互為C-20的差向異構體；其次說明了化學位移C-17，C-21相對在高場、C-22化學位移相對在低場的化合物是R構型，反之是S構型。主成分化合物實測數據，C-17，C-21相對在低場，C-22相對在高場，說明是S型。

人參皂苷Rh2為已知結構化合物，將其13C-NMR數據與文獻數據比較，可以看出，從人參次苷H中分離得到的主成分與文獻報道[7]的20（S）-人參皂苷Rh2的數據一致，而以西洋參莖葉總皂苷經酸降解后分離得到的主成分的差向異構產物與文獻報道[7]的20（R）-人參皂苷Rh2的一致。

3.3 單晶衍射數據對20位碳S構型的推定

從X-射線衍射立體結構投影圖可以看出空間排布，C-20手性碳所連的4個基團按優先性大小順序規則排列：羥基>苷元母核>C-22側鏈>C-21甲基；以C-20手性碳為中心畫出楔形式（圖6）：

將優先順序最小的C-21甲基放在離眼睛最遠處看其他三個基團，按從大到小的旋轉方向是逆時針，說明C-20手性碳是S構型。

4 結論

本研究首次制得20（S）-人參皂苷Rh2單晶，采用X-射線單晶衍射結合13C-NMR分析，均證明人參次苷H主成分人參皂苷Rh2的C-20構型為S型。

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（收稿日期：2013-03-14）