Scorpions—ARMS法檢測非小細胞肺癌患者外周血EGFR基因突變及其臨床預測價值的研究

[摘要] 目的 應用蝎形擴增阻滯突變系統（Scorpions-ARMS）檢測非小細胞肺癌患者外周血EGFR基因突變及其臨床預測價值的研究。 方法 應用蝎型擴增阻滯突變系統（Scorpions-ARMS）檢測非小細胞肺癌外周血中EGFR基因第18、19、20及21外顯子突變，統計分析EGFR基因突變的相關因素。結果 50例非小細胞肺癌患者中，EGFR基因的突變率為30%（15/50）。 結果 EGFR基因的突變率47.4%（女性）明顯高于19.4%（男性）。非吸煙患者EGFR突變率45.5%高于吸煙患者 17.9%，差異有統計學意義（P = 0.035）。在非小細胞肺癌患者中，腺癌患者EGFR 突變率40.6%明顯高于非腺癌患者11.1%，差異有統計學意義（P = 0.029）。 結論 Scorpions-ARMS是檢測血清游離DNA中EGFR基因突變的可靠有效方法。

[關鍵詞] 非小細胞肺癌；基因突變；表皮生長因子受體；蝎形擴增阻滯突變系統

[中圖分類號] R734.205 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2013）14-0001-02

肺癌是當今世界各國最常見的惡性腫瘤之一，是導致人類死亡的首要疾病和主要原因。由于初期肺癌患者缺乏明顯的臨床癥狀，近75%患者在進行首診時病變已屬晚期，失去根治性手術的機會。然而姑息性手術或輔助性治療僅能部分改善癥狀，并未起到改善癥狀以及延長生命的作用[1]。吉非替尼和厄洛替尼等表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑可選擇性地抑制EGFR酪氨酸激酶區的活化，阻斷EGFR信號轉導通路，可用于至少一次化療失敗后的局部晚期或轉移性非小細胞肺癌的治療。研究顯示，EGFR基因突變狀態能夠預測EGFR-TKIs的治療效果[3，4]。

近年來大量研究表明，外周血EGFR與組織EGFR兩者突變檢測具有較高的一致性，因此用外周血檢測EGFR基因突變情況是切實可行的，并可以實時監測疾病進展，較早發現獲得性耐藥，以給予更好的治療與預防[5-8]。目前，外周血EGFR突變檢測方法主要有變性高效液相色譜法（DHPLC）、突變富集PCR、蝎形擴增阻滯突變系統（Scorpions-ARMS）以及微流體數字PCR技術等[9-11]。

Scorpions-ARMS因其具有高靈敏性和特異性，且操作簡單快速，可作為檢測EGFR突變的新型定量PCR方法。文獻報道使用Scorpions-ARMS方法測定晚期肺癌患者血清和腫瘤組織EGFR基因檢測的一致性可達到72.7%[12，13]。因此本研究采用敏感性高的Scorpions-ARMS技術，選擇易于采集并能準確反映腫瘤組織狀態的外周血作為標本進行研究。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

2011年6月～2012年6月我院收治并接受手術治療的NSCLC患者50例。年齡25～78歲，中位年齡60歲；28例有吸煙史；根據ICC2009年新的第七版修訂標準進行TNM分期，III期29例，IV期21例；按WHO肺癌組織分類標準進行組織分型，腺癌32例，鱗癌15例，大細胞肺癌2例，肺泡癌1例。

1.2 標本獲取

取得患者及其家屬知情同意后，清晨空腹抽取患者外周靜脈血5 mL置于潔凈EDTA抗凝管中，-80℃冰箱凍存備用。

1.3 DNA的提取

外周血DNA提取按照QIAGEN試劑盒說明進行。

1.4 Scorpions-ARMS檢測EGFR基因突變

對提取的DNA進行EGFR基因突變檢測采用DxS公司EGFR 29 Mutation Kit試劑盒和IQ5實時熒光定量PCR儀，按照DxS試劑盒的說明書步驟進行操作，對患者進行必要的結果觀察。

1.5 統計學分析

將所有臨床病理資料數據進行分析統計，應用SPSS 17.0 統計學軟件，采用χ2檢驗對兩組患者進行分析檢驗。

2 結果

2.1 NSCLC患者中EGFR基因突變檢測結果

在50例NSCLC癌患者外周血血清標本中，共檢測出EGFR基因突變15例（30%）。在這15例突變中，外顯子19發生缺失突變有11例，外顯子21發生突變有4例，為L858R點突變（見圖1）。未檢測到外顯子18及20突變。

2.2 NSCLC患者中EGFR基因突變與臨床病理特征之間的關系

在50例NSCLC癌患者外周血血清標本中，從結果可以得出，在臨床特征方面：性別（男/女），組織學類型（腺癌/非腺癌）以及吸煙史（有/無）等方面的比較，差異具有統計學意義，而與年齡（≤60歲/>60歲）以及TNM分期（Ⅲ期/Ⅳ期）方面無關。見表1。

3 討論

3.1 外周血EGFR基因突變檢測可行性

EGFR基因突變檢測的取材不一定僅限于從腫瘤組織獲得，也可以從外周血中獲取。癌細胞的凋亡、壞死以及從原發病灶脫落的微轉移癌細胞為肺癌患者外周血中提供了源于腫瘤組織的遺傳物質，進入血循環，且外周血EGFR突變的檢測與組織EGFR突變檢測具有較高的一致性，因此外周血用于檢測EGFR基因的突變情況是切實可行的[14]。因此，本研究選取非小細胞肺癌患者外周血作為檢測對象，患者屬于臨床分期Ⅲ期7例（24.1%），Ⅳ期8例（38.1%），說明癌細胞隨著患者病情的發展，檢測概率也會跟隨檢測基因進行跟蹤，檢測外周血EGFR基因突變，也是腫瘤發生突變的根據之一，為患者的治療提供相關的證據，可以進一步減少腫瘤的復發、轉移以及惡化，提高治愈率和生存率[15]。

3.2 Scorpions-ARMS技術的運用

目前DxS EGFR 29 Mutation Kit檢測基因突變是公認的用來檢測EGFR的最敏感方法，對突變檢測的靈敏度可達1%。其核心技術為ARMS技術和Scorpion 技術的結合，Scorpion檢測技術靈敏度更高。DxS EGFR 29 Mutation Kit可對EGFR基因突變的酪氨酸激酶區18-21外顯子上的29種突變進行檢測，Scorpions-ARMS結合實時定量PCR可以對樣品中的微量基因突變進行檢測，實現了高自動化、高靈敏度的目標。

3.3 EGFR基因突變的相關因素

本研究中EGFR基因突變可能與臨床病理特征具有相關性，實驗結果顯示女性患者EGFR基因突變率高于男性患者，不吸煙患者EGFR基因突變率高于吸煙患者，以及腺癌患者的EGFR基因突變率顯著高于非腺癌患者，差異有統計學意義，有待進一步研究和驗證，考慮可能是本研究的樣本量太小。游離DNA含量與原發腫瘤的分期密切相關，EGFR基因突變較多，分析原因可能是非小細胞肺癌晚期患者原發腫瘤較大，可能伴有遠處轉移的潛能以及從母體脫落入血的腫瘤細胞數目增加，導致主動入血的突變DNA含量增加，檢出突變的可能性也隨之增加。

4 展望

目前，Scorpions-ARMS技術因其具有高靈敏度和特異性，在短時間內即可檢測出最常見的EGFR基因突變，同時具有操作簡單快速的優勢，現已成為腫瘤個體化分子檢測最重要、最先進的技術之一，現已作為EGFR突變的常規檢測方法，在臨床實踐中得以應用和開展。

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（收稿日期：2013-02-04）