308nm激光聯合胡椒堿在白癜風動物模型中的應用研究

[摘要] 目的 探討308 nm激光聯合胡椒堿對豚鼠表皮中黑素細胞的影響，觀察聯合療法對實驗動物的安全性和療效。 方法 豚鼠背部分別以聯合療法組、308 nm激光組、胡椒堿組、陽性對照組及空白對照組作用。5周后對不同觀察組脫色區皮膚進行色素生成肉眼觀察和皮膚活檢。觀察治療前后病理切片中黑素顆粒的改變及黑素細胞數目。 結果 治療5周后，肉眼觀察除空白對照組外，4組均能促進豚鼠皮膚色素沉著。聯合治療組多巴陽性黑素細胞數及黑素顆粒均較其他3組不同程度增多（P < 0.05），與陽性對照組比較差異無顯著性（P > 0.05）。結論 308 nm激光聯合胡椒堿對豚鼠背部皮膚有明顯增色作用，具有促進黑素增值和黑素合成的功能。

[關鍵詞] 308 nm激光；胡椒堿；黑素細胞；豚鼠

[中圖分類號] R758.4+1；R285.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）28-0013-03

白癜風是臨床常見的色素脫失性皮膚病，病因及發病機制不明[1]。研究發現，酪氨酸酶在白癜風發病中起關鍵作用[2]，在正常情況下，其氧化的中間物的破壞作用可能為一種保護機制所消除，一旦缺少此種保護機制，黑素細胞便有被破壞的可能。我們曾對308 nm激光聯合胡椒堿對小豚鼠B16黑素瘤細胞黑素合成的影響進行研究，發現308 nm激光聯合胡椒堿對酪氨酸酶及酪氨酸相關蛋白酶具有較強的激活及保護作用。在此基礎上以棕色豚鼠為動物模型進行動物實驗，研究聯合療法對動物的安全性、療效及作用機制，為今后治療白癜風患者奠定基礎。

1 材料與方法

1.1實驗材料

健康棕黃色豚鼠10只，重量250～350 g，中國科學院昆明生物所購買。誘導型一氧化氮合酶（iNOS）抗體、左旋多巴、DAB染料、SP免疫組化試劑盒均由湖北Dr.too生物公司購買，其他試劑為市售合格產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組 分5組。聯合療法組：308 nm準分子激光（EL）以能量300 mJ/cm2照射并聯合0.5 mmo/L 胡椒堿；EL激光組：僅以能量300 mJ/cm2照射豚鼠；胡椒堿組：以0.5 mmol/L胡椒堿作用于豚鼠；陽性對照組：EL聯合8-Mop（0.1 mmol/L）；空白對照組：僅加入等量相應溶媒，不照射。

1.2.2 實驗方法 照射方法 豚鼠背部脫毛。隨機取4個相離區域，各組累積照射劑量為300 mJ/cm2，照射起始劑量按200 mJ/cm2。以后根據紅斑反應適當調整。未出現紅斑或發生紅斑持續未超過24 h者，加（50～100） mJ/cm2；超過24 h者劑量不變；出現明顯反應者，暫停治療，癥狀緩解后下次照射劑量減少（50～100）mJ/cm2，每周治療3次。胡椒堿濃度設定為0.5 mmol/L，8-Mop實驗濃度為0.1 mmol/L，2次/d，連續治療5周，對照射過部位皮膚進行活檢，做不同染色。

1.2.3 聯合療法對白癜風豚鼠模型脫色區色素生成肉眼觀察 肉眼觀察色素恢復情況，恢復程度以百分比計。

1.2.4 HE染色 常規石蠟切片，蘇木一伊紅染色。

1.2.5 聯合療法對白癜風豚鼠模型脫色區色素生成實驗評價

（1）黑素合成情況檢測 Fontana-Masson法對黑素顆粒進行染色。黑素顆粒分布標準為5級：1級為棘層和基底層細胞少量黑素顆粒；2級為以基底層為主不連續的黑素顆粒；3級為以基底層和棘層為主的連續呈帶狀分布的黑素顆粒；4級為在3級基礎上黑素顆粒呈大量連續的分布；5級為黑素顆粒密布于表皮全層。（2）MC增值情況 Zmokawa染色。用0.1 mol/L PBS液沖洗，置于1 mol/L溴化鈉37℃，5 h分離真表皮，PBS洗滌數次，表皮用5%福爾馬林固定， 0.1%多巴染色5 h，于顯微鏡下觀察，分別計數5個視野基底層所含多巴陽性數，取平均值。

1.3 統計學處理

采用成組計量資料F檢驗，統計過程使用SPSS 10.0統計軟件完成。

2 結果

2.1 皮膚反應

聯合治療組治療5周后，肉眼觀察評分為3分，有深褐色色素沉著，空白對照組無明顯色素恢復評分為0分。陽性對照組、EL激光組及胡椒堿組均能不同程度促進豚鼠皮膚色素沉著。聯合治療組作用最強。治療中所有治療組未見任何皮膚不良反應。

2.2 不同觀察組對棕黃色豚鼠背部皮膚多巴陽性黑素細胞增殖的影響

見表1和圖1～5。 結果發現， 4個不同觀察組均能不同程度地增高表皮基底層多巴陽性細胞數，其中以聯合治療組作用最明顯。聯合治療組作用較空白對照組有顯著性差異（t=78.32，P<0.01），較EL激光組及胡椒堿組差異有統計學意義，（t=10.56，22.53；P<0.05）。較陽性對照組差異無顯著性（t=1.02，P>0.05）。

2.3 不同觀察組對棕黃色豚鼠背部皮膚黑素生成的影響

見表1。Fontana-Masson染色后，聯合治療組黑素顆粒分布情況為5級，黑素顆粒密布表皮全層，提示聯合療法組對皮膚黑素合成具有促進作用。空白對照組為1級，差異顯著（t=23.09，P<0.01），陽性對照組為4級，無統計學差異（t=1.03，P>0.05）。

3 討論

白癜風是臨床最常見的皮膚和黏膜色素脫失性疾病[3]。實驗研究證實，皮損處黑素細胞（melanocyte，MC）的缺失和減少是患者皮膚出現色素減退斑的關鍵環節[4]。白癜風嚴重影響患者容貌美觀，給患者的心理健康帶來明顯的損害。盡管目前關于白癜風的發病機制尚存在多種學說，如自身免疫、氧化應激造成MC破壞或者功能受損等，但最終造成的結果就是MC減少、缺失和功能抑制[5]。因此白癜風的治療也應著眼于增加皮損區MC數量，活化MC功能。酪氨酸酶是皮膚黑素生成的主要促進酶。許多治療都是通過上調該酶的生物活性來發揮作用的[6]。酪氨酸相關蛋白酶TRP-1和TRP-2可催化黑素生化合成過程中的后續步驟，在黑素細胞內他們與酪氨酸酶一起以多酶復合體形式存在，并對該復合體起穩定作用。治療上，盡管目前方法很多，但各種方法療效均不確切。308 nm準分子激光是連續的脈沖氣體激光，屬UVB波長范圍[7]。EL是白癜風治療領域最新的手段之一，其有效率高于其他方法已得到國內外研究的公認[8，9]。盡管擁有了這一手段，整體而言，白癜風治療有效率仍不令人滿意[10]。本研究聯合胡椒堿治療，胡椒堿對黑素細胞的促進作用在其他學者的研究中已得到認可[11，12]。筆者前期研究證實308 nm激光聯合胡椒堿療法可促進黑素合成及上調酪氨酸酶及酪氨酸相關蛋白酶活性，促進黑素沉著，明確了聯合療法作用的實驗室依據。

為明確聯合療法在活體上的作用，我們選擇棕色豚鼠作為動物模型，依據為棕色豚鼠皮膚黑素細胞與黃種人相類似，為聯合療法用于患者奠定初步基礎。觀察中我們發現，治療5周后，肉眼觀察聯合治療組、陽性對照組、EL激光組及胡椒堿組均能不同程度促進豚鼠皮膚色素沉著，以聯合治療組作用最強。研究還發現，4組均能使豚鼠皮膚多巴陽性細胞數和含黑素顆粒細胞數不同程度的增高。聯合治療組作用最強。不同觀察組對豚鼠皮膚均無不良反應。本動物實驗的成功為臨床治療白癜風提供了有力的實驗依據。

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（收稿日期：2013-08-12）