不同耕作處理結合施肥、秸稈還田對土壤微生物多樣性的影響

摘 要：為了探索不同耕作處理對土壤耕層和犁底層微生物數量及其多態性的影響，對吉林省公主嶺周邊和長春農安等地進行田間試驗并采集土壤，通過室內實驗對土壤進行PCR擴增以及DGGE圖譜分析等研究。結果表明：不同耕作處理下，耕作層和犁底層土壤微生物均較農民常規耕作下土壤微生物種群結構多樣性有所增加。通過DGGE圖譜條帶分析計算得出土壤香濃威爾多樣性指數（香濃指數），顯示在耕作層土壤中同一層面不同樣地的微生物種群結構具有較高的相似性；不同樣地同一深度的犁底層土壤微生物種群結構同樣具有較高的相似性。通過該試驗的研究最終得出結論：旋耕一體機配合作物根茬還田是增加土壤微生物種群結構多樣性的最佳組合方式。

關鍵詞：土壤微生物；PCR-DGGE；聚類分析；香濃威爾指數

中圖分類號 S15 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2013）24-65-04

在土壤養分循環的過程中，土壤微生物發揮著積極的作用，是土壤肥力的重要指標[1]，土壤微生物幾乎是全部土壤生物化學過程的參與者，不但能提升土壤中有效養分的含量，還為作物生長和產量提供必要的物質保障[2]。由于人們長期對土壤進行農事操作，改變了土壤物理生物化學屬性，因此對農田土壤微生物的主要類群和重要功能群的數量影響也愈見強烈，進而可能影響耕地質量保育與生態環境安全[3-4]。大部分土壤微生物對耕作措施很敏感，會表現出不同的反應[5-6]。其多樣性對生態系統的穩定性、生產力和應對壓力與擾動的恢復力方面有著重要的影響[7]。Al-Kaisi和Liebig等研究都表明，保護性耕作較傳統耕作更有利于增加土壤中微生物多樣性和生物量且更集中于地表，進而提高土壤系統穩定性。加之長期高強度的農藥化肥大量投入使用也極易降低土壤中微生物群落多樣性，導致微生物功能喪失，進一步影響土壤質量，使得土壤障礙頻發[8-9]。研究結果表明恰當的管理制度能夠增加土壤微生物種群數量，進而有利于作物產量的提高，土壤質量也會隨之改善[10-11]。Schutter等利用PLFA法對保護性耕作和傳統耕作下土壤微生物多樣性進行了研究，發現對比傳統耕作，保護性耕作更能增加土壤微生物種群數量。

1993 年，Muy zer 等首次將PCR-DGGE（Polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis）技術應用于微生物生態的研究，這一技術的出現克服了傳統微生物培養技術的限制，由于PCR-DGGE 具有可靠、方便快捷、重現性好等優點，迅速成為微生物群落多樣性和動態分析的強有力工具[12]，它利用PCR擴增產物中G+C含量的rDNA組分在電泳凝膠中移動的位置上的差異，不同G+C含量在膠中移動的速度不同，因此產生不同代表微生物群落組成的條譜帶。本試驗通過測定不同耕作方式下土壤微生物數量以及在分子水平上利用PCR-DGGE技術研究不同耕作方式下的農田管理措施對土壤微生物群落多樣性的影響，從理論上闡明適合的耕作方式和農田管理模式，為土壤質量的改善和生產力的提高，提供重要的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗區概況 試驗在吉林省農田進行，試驗地土壤為典型黑土。全省大部分地區年平均氣溫為2～6℃，全年日照2 200～3 000h，年活動積溫平均在2 700～3 200℃，年降水量一般在400～1 300mm。受季風氣候影響，吉林省四季降水量以夏季最多，占全年降水量的60%以上，對作物生長十分有利。

1.2 供試土壤與樣品采集 本研究選擇4種處理：（1）陶家子（TH）：玉米收割后根茬還田，次年旋耕四位一體機進行播種施肥一次性作業；（2）永發鄉（YH）：玉米收獲后秸稈全部粉碎回田，兩年播種前深翻一次后持續免耕；（3）農安（NH）：玉米收割后1/3秸稈粉碎還田，次年深翻；（4）公主嶺（AH）：深翻配施有機肥。各處理設置的同時均有農民現行耕作對照。土壤樣品采集于2011年10月中旬，供試土壤為中上層黑土，試驗采取3點取樣法，去除土樣雜質、細根，將鮮土保存在4℃冰箱中待測。

1.3 土壤DNA提取與PCR擴增 采用FastDNA SPIN Kit for Soil土壤DNA提取試劑盒。按試劑盒規定的實驗步驟進行土壤DNA的提取，所提取的DNA用試劑盒純化后保存。每個樣品3次重復，以341f，758r（生工合成）為引物，在PTC-200PCR儀（Bio-Rad，美國伯樂公司）上進行擴增。PCR反應體系為50μL，包括10×buffer 5μL，10mmold NTP 4μL，10pm正反引物各1μL，taqDNA聚合酶0.4μL，無菌水37.5μL，模板1μL。（大連寶生物公司）。PCR擴增程序為：94℃預變性5min；94℃變性1min，65℃（-0.5℃ per cycle）退火1min，72℃延伸1min，20個循環；94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，12個循環；72℃延伸10min。

1.4 樣品的DGGE分析 用擴增的PCR產物進行DGGE分析，所用儀器為D-Code Universal Detection Mutation system （Bio-Rad，美國伯樂公司），凝膠成像系統（Bio-Rad，美國伯樂公司）。DGGE的凝膠濃度為6%，變性梯度為30%～60%，在60℃，180V條件下電泳6h.電泳膠片用Genefinder熒光染料染色。

1.5 數據處理 試驗數據采用Quantity One4.2.3軟件，采用非加權成對算術平均法（UPGMA）對所有土壤樣品進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 不同耕作方式對農田耕層土壤微生物多態性的影響 對耕層土壤微生物的PCR擴增產物進行DGGE電泳，分別得到不同地區土壤細菌的DGGE圖譜。從圖1中能夠清晰的看出菌群的整體分布多樣性和優勢菌的分布和數量。各樣品的細菌DGGE圖譜的條帶數、條帶位置和亮度呈現明顯的差異。DGGE凝膠電泳能夠分離長度相同而序列不同的DNA條帶，條帶越多說明生物多樣性越豐富，條帶信號越亮表示對應該條帶的細菌數量越多，從而可反映出微生物的數量和種類[13]。不同處理間有很多共有條帶，說明處理間微生物群落結構具有很強的相似性，然而這些共有條帶粗細強度的差異，說明同一種微生物在不同處理內豐度不同。不同處理間出現的條帶的增加或缺失現象，說明不同處理間微生物多樣性存在一定的差異。圖1顯示，3種處理耕作方式TH/YH/NH都較它們的傳統方式TS/YL/NL土樣條帶數量多，亮度強。其中NH/NL組條帶數目差異明顯，NH較NL條帶數量變化最多；TH較YL條帶亮度變化最強；TH較TS在數量及亮度上也有變化，但是變化幅度較小。表明不同耕作處理下的農田土壤微生物多樣性較農民常規耕作下土壤微生物多樣性豐富。

圖1 不同耕作方式下耕層土壤細菌DGGE圖譜

進一步利用Quantity One4.2.3對DGGE圖譜進行數字化處理，通過UPGMA方法進行聚類分析，得到不同耕作下土壤微生物組成的聚類分析系統樹。結果如圖2所示，圖2中處理分為2個族群，NL點處為一個族群，其余TH/YS、YH/TL和NH為另一個族群。說明深翻結合秸稈還田能夠改變土壤中微生物組成。說明細菌群落結構類型因耕作方式不同，表現出明顯差異。聚類分析系統樹顯示TH/TS、NH/NL均首先聚類，表明其土壤中微生物種群結構較為接近；YH/YL未首先聚類，說明深翻配施秸稈還田促進土壤微生物種群結構的多樣性。

圖2 不同耕作處理與傳統耕作耕層土壤微生物組成的聚類分析

2.2 不同耕作方式對農田犁底層土壤微生物多態性的影響 應用PCR擴增產物對土壤犁底層微生物進行DGGE電泳分析，分別得到犁底層細菌DGGE圖譜條帶，如圖3顯示。同樣，從圖3中能明顯看出，犁底層中TH/YH/NH的條帶數量及亮度方面要較TS/YL/NL等傳統耕作土壤中微生物數量大，亮度強。

圖3 不同耕作方式下犁底層土壤細菌DGGE圖譜

圖4聚類分析系統樹中顯示，TH/NH和TS/NL首先聚類，說明四位一體耕作方式和深翻結合1/3秸稈還田對土壤微生物種類結構沒有影響；并且NL/TS以及NH/TH的聚類結果顯示不同樣地同一深度的犁底層土壤微生物具有較高的相似性。

圖4 不同耕作方式下犁底層土壤微生物組成的聚類分析

2.3 不同耕作方式對農科院試驗田耕層和犁底層土壤微生物多態性的影響 通過Quantity One軟件包對農科院試驗站的土樣進行DGGE圖譜分析發現，如圖5所示，C點耕層（0～20cm）條帶數較傳統耕作的耕層A點（0～20cm）條帶數多且條帶明亮，D點犁底層（20～40cm）條帶數較傳統耕作B點犁底層（20～40cm）條帶數多且條帶較亮，說明施入的有機肥能增加土壤中微生物的種類和數量。

注：A=Al（0～20cm）；B=AL（20～40cm）；C=AH（0～20cm）；D=AH（20～40cm）。

圖5 不同耕作方式下耕層與犁底層土壤細菌DGGE圖譜

從圖6的聚類分析系統樹看出A、B、D三點首先聚類，而C點未能與其聚類，由此可以說明深翻配施有機肥同樣能夠促進耕層土壤微生物種群結構的多樣性。

圖6 不同耕作方式下耕層與犁底層土壤微生物組成的聚類分析

2.4 不同耕作制度下土壤微生物香濃威爾多樣性的影響 根據土壤在DGGE圖譜上的條帶信息，計算出的Shannon-weiner多樣性指數，如表1所示。從表1中看出，4種不同耕作處理下的土壤微生物香濃指數都較農民常規耕作下微生物香濃指數高，說明4種耕作方式都能促進土壤微生物種群結構的多樣性。這可能是由于4種耕作處理可以為土壤微生物提供相應的養分和適宜的生存環境，促使各類微生物很好的生長，因而微生物多樣性指數較高。四位一體耕作方式下土壤微生物的香濃指數增幅最大，耕層和犁底層分別為23.2%和15.5%，

表1 不同耕作與常規耕作耕層土壤與

犁底層土壤香濃威爾多樣性指數

[耕作＼1＼2＼3＼4＼4種耕作＼耕作層＼2.39＼2.38＼2.36＼2.63＼＼犁底層＼2.00＼2.04＼2.25＼2.38＼常規耕作＼耕作層＼1.94＼2.30＼2.25＼2.48＼＼犁底層＼1.70＼1.92＼2.01＼2.29＼]

3 結論與討論

黑土土壤中的微生物具有數量大、種類繁多等特性，因此本實驗采用了16S rDNA擴增的DGGE方法研究不同耕作制度下土樣微生物群落的多樣性。通過分析農民常規耕作下農田土壤與不同耕作處理下農田土壤中微生物組成的DGGE圖譜，顯示了不同樣地或同一樣地不同深度土層土壤微生物組成的多態性。微生物是農田土壤中的核心組成部分，不但能為作物提供營養元素和最佳的生長環境，還能保持土壤的基本生產力。有研究表明，腐解的秸稈扮演著養分和載體的角色[14]，能夠增加有機碳含量進而改善土壤環境，顯著降低土壤pH值，增加土壤微生物數量。因此，對于促進作物生長、改善和提高土壤質量具有重要作用[15]，施肥可以增加根系的分泌物，給土壤微生物提供能源物質，進而提高土壤微生物量[16]。從DGGE圖譜中看出（圖1、圖3、圖5），耕層土壤微生物組成中TH/YH以及AH的電泳條帶都較TS/YL和AL電泳條帶數量多，亮度強；對犁底層來講，同樣是不同耕作措施下土壤微生物要較傳統耕作下土壤微生物類群豐富，種類繁多。這說明了增施有機肥或秸稈還田都能明顯增加土壤微生物類群和數量。這與施用有機肥可以維持較高的土壤微生物活性，保持微生物多樣性與生態穩定性相一致[17]。秸稈還田可以為微生物的生長活動提供必要的能源和營養物質，加快刺激土壤中微生物的活性，從而加快土壤中微生物的自身物質合成，并利用外源養分進行新陳代謝[18]；有結果表明農民常規耕作模式下土壤微生物的DGGE條帶數明顯少于適宜的耕作模式處理，說明農民常規耕作降低了土壤細菌群落的多樣性[19]。利用Quantity One4.2.3軟件對土壤DGGE圖譜進行的聚類分析顯示，無論是傳統耕作還是不同耕作制下同一地區不同深度土壤的微生物組成具有多態性。

就Shannon-Weiner指數而言，不同耕作下的土壤耕層香濃指數都較農民常規耕作下耕層香濃指數高，這是由于秸稈還田可以直接為土壤微生物提供充足的有效養分，改善土壤微生物棲息環境[14]，提高了耕層土壤生態環境的緩沖能力。而犁底層可能是由于養分運輸的限制，微生物不能得到充足的營養和適宜的生存環境，所以在類群功能和數量上不能像表層微生物那樣豐富。通過對比不同耕作措施下的微生物香濃指數，發現陶家子耕作方式下土壤微生物多樣性變化最高，耕層和犁底層增幅分別為23.2%和15.5%。推測其可能原因是根茬還田補充輸入了有機碳源又改善了土壤物理性狀，有利于維持土壤微生物的多樣性及活性[20]，另外旋耕增強了土壤的通氣能力，同時也使土壤的孔隙度增加，因此微生物的活動能力也相應的增強。

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