黃肉甘薯糖蛋白的抗氧化作用研究

摘 要：為深度開發薯類產品，以黃肉甘薯為材料，探索其糖蛋白的抗氧化作用，以期為甘薯產品的開發提供一條新的思路。經水溶浸提、乙醇沉淀、脫游離蛋白和透析等方法，從甘薯中提取糖蛋白；并研究了其對O2-˙、·OH和H2O2的清除能力，及其還原能力和對食用油脂的抗氧化作用。實驗結果表明：黃肉甘薯糖蛋白對鄰苯三酚自氧化產生的O2-˙、Fe-H2O2體系產生的·OH和H2O2具有較高的清除活性，并具有較好的抗食用油脂氧化作用和還原能力。以上活性都與糖蛋白的濃度呈一定的量效關系，表明黃肉甘薯糖蛋白擁有良好的綜合抗氧化能力。

關鍵詞：黃肉甘薯；抗氧化活性；糖蛋白；自由基；還原能力

中圖分類號 S531 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2013）18-18-03

在自然界中，糖蛋白廣泛存在于動物、植物和一些微生物中，在生物體內以不同形態存在而發揮作用，是細胞間基質、細胞膜、粘液、血漿、激素等的重要組成成分。糖蛋白由糖鏈部分和蛋白部分組成，目前國內研究已經測定出甘薯糖蛋白的組成，并對其性質做了初步的研究。糖蛋白通過糖肽鍵將糖鏈和肽鏈兩部分連接起來，糖蛋白是蛋白和糖類共價結合的復合物，其中的糖鏈少則一個，多有數百個[1]。日本的研究人員發現，甘薯含有豐富的糖蛋白，對人體有特殊的保護作用，能維持呼吸道、消化道、漿膜腔和關節腔的潤滑和心血管的彈性，預防脂類物質在動脈管壁上沉淀而引起的動脈硬化，從而減緩了人體器官的衰老速度等。近來，巴西的營養學專家指出，甘薯糖蛋白具有防治白血病、糖尿病等多種疾病的功效。國內的研究結果也表明，甘薯糖蛋白具有很好的降血脂功能[2]和抗腫瘤作用[3]。甘薯糖蛋白作為具有重要生理活性的天然提取物，在功能食品、藥物制造等方面具有廣闊的應用潛力。可作為功能食品的功能成分來使用，也可將其進一步分離純化后單獨生產制劑，或者作為其它功能藥物的復配成分使用。本研究旨在研究甘薯糖蛋白的抗氧化作用，探索甘薯糖蛋白是否是良好的天然抗氧化劑，以期提高甘薯的綜合利用率，為甘薯糖蛋白用于功能食品、藥物制造提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 甘薯：紅皮黃肉，市售。鄰苯三酚、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）、2–脫氧–D–核糖（DR）、2–硫代巴比妥酸（TBA）、鐵氰化鉀、三氯乙酸（TCA）等均為分析純。主要儀器：DZKW型恒溫水浴鍋，北京永光明醫療儀器廠；DHG-9246A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；UV-2000型紫外可見分光光度計，上海洪福儀器儀表有限公司；5810r型高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 甘薯糖蛋白的制備 甘薯干→粉碎→過80目篩→稱重→1∶15加水→恒溫提取（40℃，3h）→過濾除渣→離心（4 000r/min，30min）→上清液濃縮→離心（4 000r/min，30min）→上清加3倍體積的乙醇醇析糖蛋白→離心分離（4 000r/min，30min）→棄上清→蒸餾水溶解沉淀→離心分離（4 000r/min，30min）→取上清、用Sevag法除非糖蛋白（V氯仿∶V正丁醇為4∶1；V樣液∶VSevag試劑為3∶1）→離心（4 000r/min，8min）→取上清透析除雜→濃縮→離心（4 000r/min，30min）→上清液醇析→沉淀干燥→糖蛋白混合物。

1.2.2 清除 O2-˙能力的測定 采用鄰苯三酚自氧化法[4]，0.1mL不同質量濃度（0、75、150、300、600μg/mL）的糖蛋白，加2.4mL 0.05mol/L Tris–HCl緩沖液（pH8.2），混勻后加入0.3mL 7mmol/L的鄰苯三酚，混勻，測[A325]值（A1），在4min時加入1滴10mol/L HCl中止反應，測[A325]值（A2）。計算抑制率：P（%）=（△A0–△A1）/△A0×100，△A=A2–A1。A0為空白吸光度，A1為試樣吸光度。

1.2.3 清除·OH能力的測定 參照劉主等[4]的方法測定甘薯糖蛋白清除·OH的能力。在試管中依次加入0.1mL不同質量濃度（0、75、150、300、600μg/mL）的糖蛋白，0.4mL磷酸緩沖液（50mmol/L，pH7.5），0.1mL 1.04mmol/L的EDTA溶液，0.1mL 2mmol/L的Vc，0.1mL 10mmol/L的H2O2，0.1mL 1mmol/L的FeCl3和0.1mL 60mmol/L的 DR溶液（對照不加DR），各管最終體積1.0mL。混勻在37℃溫浴1h后，立即加入1mL 25%（v/v）HCl終止反應，再加入1mL 1%TBA顯色，沸水浴反應15min，立即冷卻，532nm處比色。·OH清除率（%）=[A–（A1–A0）]/A×100。式中，A0為空白吸光度，A為樣品吸光度（不加DR），A1為樣品與DR吸光度。

1.2.4 清除H2O2能力的測定 參照顏棟美和姚艾東[5]的方法測定甘薯糖蛋白對H2O2的清除能力。用磷酸緩沖液（pH7.4）配制10mmol/L的H2O2溶液，取5mL H2O2溶液加入 5mL不同濃度的待測液，混勻后在248nm處測其吸光度記為A1，以不加H2O2的試樣溶液吸光度為A2，以不加試樣液的H2O2吸光度為A0。H2O2清除率（%）=[A0–（A1–A2）]/A0×100。

1.2.5 對食用油脂的抗氧化性試驗 采用烘箱貯存法測定糖蛋白對食用油脂的抗氧化性[6]。取10mL待測液，加入燒杯中，加豬油10mL，在60℃恒溫10d。取2g油樣和10mL氯仿，移入碘量瓶中，溶解后，加1mL飽和KI溶液和15mL乙酸，立即加塞，搖均1min，暗處靜置5min。加75mL蒸餾水，用0.01mol/L Na2S2O3標準液滴定。以空白作對照，計算公式為：過氧化值（PV）=（V–V0）×C/M。式中，PV為滴定1kg油樣所需Na2S2O3標準液的量（mol/kg），V0為空白消耗Na2S2O3標準液的體積（mL），V為油樣消耗Na2S2O3標準液的體積（mL），M為油樣質量（g），C為Na2S2O3標準液濃度（mol/L）。

1.2.6 糖蛋白還原能力的測定 參照顏棟美和姚艾東的方法[5]測定其還原能力。在2.5mL磷酸緩沖液（pH6.6）中加入1%的鐵氰化鉀溶液2.5mL，不同濃度的待測液2.5mL，混勻后在50℃恒溫20min，加2.5mL 10%的三氯乙酸溶液，混勻后在3 000r/min下離心 10min，取上清液 5mL，加 0.1% FeCl3溶液 1mL和蒸餾水 5mL，在 700nm下測定吸光值。

2 結果與分析

2.1 黃肉甘薯糖蛋白對O2-˙的清除作用 由圖1可知，在測定體系中加入黃肉甘薯糖蛋白，隨著甘薯糖蛋白濃度的逐步升高，對O2-˙的抑制率也逐漸增大。當甘薯糖蛋白的質量濃度為75和150μg/mL時，雖有清除鄰苯三酚自氧化反應中產生的O2-˙的能力，但效果不太顯著。當黃肉甘薯糖蛋白的質量濃度為300μg/mL時，其對鄰苯三酚自氧化反應中產生的O2-˙具有明顯的清除作用；當黃肉甘薯糖蛋白的質量濃度為600μg/mL時，其對鄰苯三酚自氧化反應中產生的O2-·具有非常明顯的清除作用。

2.2 黃肉甘薯糖蛋白對·OH的清除能力 Fenton反應生成的·OH能夠氧化降解脫氧核糖，在酸性溶液中加熱生成MDA，MDA與TBA反應生成紅色產物，該產物在532nm處有最大吸收峰，在反應體系中加入抗氧化劑能夠減少紅色產物的生成。由圖2可知，隨著甘薯糖蛋白加入量的逐步增大，其對·OH的清除作用也逐步增大。說明黃肉甘薯糖蛋白對·OH具有明顯的清除作用。

2.3 黃肉甘薯糖蛋白清除H2O2的能力 過氧化氫是細胞代謝過程中產生的常見活性氧之一，H2O2自身沒有活性，但在細胞中可進一步反應產生羥自由基，進而對細胞產生損傷，具有類似氧自由基的毒副作用。由圖3可知，在特定濃度范圍內，隨著黃肉甘薯糖蛋白濃度的逐步升高，對H2O2的清除率也逐漸增大。當甘薯糖蛋白濃度為600μg/mL時，對H2O2的清除率可高達88%，這說明黃肉甘薯糖蛋白對H2O2具有非常明顯的清除作用。[H2O2抑制率（%）][質量濃度（μg/mL）]

圖3 不同質量濃度的甘薯糖蛋白清除H2O2的能力

2.4 黃肉甘薯糖蛋白對食用油脂的抗氧化性測定 在60℃下，豬油會發生氧化，生成的過氧化產物可以和KI發生反應生成I2，I2與淀粉反應顯藍色，I2的生成量越大，顯色越深。利用Na2S2O3標準液滴定消耗的Na2S2O3量越多，過氧化值越大，表明試樣在此過程中氧化產生的過氧化物越多。由圖4可知，在一定濃度范圍內，隨著黃肉甘薯糖蛋白濃度的不斷增大，供試樣品的過氧化值逐漸減小，說明黃肉甘薯糖蛋白對食用油脂具有很好的抗氧化性。當黃肉甘薯糖蛋白濃度<300μg/mL時，甘薯糖蛋白對食用油脂的抗氧化作用比較顯著，而后隨甘薯糖蛋白濃度的增大，其抗氧化作用趨于平緩。

2.5 黃肉甘薯糖蛋白還原能力的測定 如圖5所示，在測定體系中隨著黃肉甘薯糖蛋白濃度的逐步升高，其相對應的樣品在700nm處吸光度逐步增大，即還原能力逐漸增強，說明黃肉甘薯糖蛋白是優良的電子供體，提供的電子既能使Fe3+還原成Fe2+，又可與自由基結合形成較惰性的物質，從而中斷自氧化連鎖反應。當甘薯糖蛋白濃度<150μg/mL時，其還原作用不太顯著；但當濃度>150μg/mL時，其還原能力非常明顯，具有較強的還原能力。還原能力可能與分子中未共用電子對有關，其分子結構中未共用電子對越多，還原能力越強。

3 結論與討論

本研究表明，甘薯糖蛋白對鄰苯三酚自氧化產生的O2-˙，Fe–H2O2體系產生的·OH和H2O2具有明顯的清除作用，具有較好的抗食用油脂過氧化作用和還原能力。說明甘薯糖蛋白具有較好的綜合抗氧化能力，是一種優良的天然抗氧化劑。甘薯糖蛋白對O2-˙、·OH和H2O2有直接的清除能力，表明該糖蛋白在抗炎、抗腫瘤和防衰老等方面可發揮作用。目前，國內外已將抗氧化檢測用于抗衰老等功能食品的評價，因此黃肉甘薯糖蛋白對功能食品的研發具有積極的作用。

參考文獻

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[2]華松，賈戰生，武浩，等.甘薯糖蛋白對小鼠血脂水平的影響[J].中國農學通報，2006，22（4）：1-3.

[3]錢建亞，劉棟，孫懷昌.甘薯糖蛋白功能研究——體外抗腫瘤與Ames實驗[J].食品科學，2005，26（12）：216-218.

[4]劉主，高建林，朱必鳳，等.甘薯糖蛋白的體外抗氧化作用研究[J].食品與生物技術學報，2007，26（2）：38-42.

[5]顏棟美，姚艾東.金花茶多酚抗氧化性能的研究[J].河南工業大學學報：自然科學版，2009，30（2）：42-45.

[6]張燕平，張虹，洪泳平，等.羊棲菜提取物體外自由基清除能力的研究[J].鄭州工程學院學報，2003，24（1）：50-53. （責編：施婷婷）