豬DIO3基因組織表達(dá)譜及印記分析

摘要：采用熒光定量PCR方法分析了豬DIO3基因在組織中的表達(dá)狀況。結(jié)果表明，DIO3基因主要表達(dá)于背部脂肪組織，在肝臟、子宮、腎臟、心臟、小腸、肌肉和胃組織中呈中度表達(dá)，在脾臟和肺臟中表達(dá)量很低。采用外顯子687 bp處的A/C突變（A/C 687）檢測(cè)該基因在豬胚胎組織中的印記狀態(tài)，DIO3基因在所有組織中均表現(xiàn)為印記。

關(guān)鍵詞：豬；DIO3基因；組織表達(dá)譜；印記分析

中圖分類號(hào)：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）21-5345-03

Expression and Imprinting Analysis of Porcine DIO3 Gene

QIAO Mu1，WU Hua-yu1，HUANG Jing-shu2，PENG Xian-wen1，DU De-li3，LI Han-he3，

ZHANG Kai-xuan3，MEI Shu-qi1

（1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary/Hubei Key Laboratory of Animal Embryo Engineering and Molecular Breeding， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064， China； 2.Animal Husbandry and Veterinary Bureau of Hubei Province，Wuhan 430064， China； 3.Wuhan Tianjian Agricultural Development Co.， Ltd.，Wuhan 430300，China）

Abstract： Real-time RT-PCR was performed to analyze the porcine DIO3 gene tissue expression pattern. The porcine DIO3 gene was expressed predominantly in backfat， mildly in liver， uterus， kidney， heart， small intestine， muscle and stomach， and almost absent in spleen and lung by realtime fluorescence quantitative PCR. A single nucleotide polymorphism in exon （A/C687） was used to investigate imprinting status in porcine embryonic tissues. The results indicate that DIO3 was imprinted in all the tested tissues.

Key words： pig； DIO3 gene； tissue expression； imprinting analysis

甲狀腺素脫碘酶Ⅲ（Deiodinase iodothyronine type Ⅲ，DIO3）能夠使四碘甲狀腺原氨酸（T4）和三碘甲狀腺原氨酸（T3）內(nèi)環(huán)脫碘導(dǎo)致甲狀腺激素失活[1]，在甲狀腺激素代謝過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[2]。甲狀腺激素是調(diào)節(jié)機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育及調(diào)控碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)等三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝的重要因子，DIO3基因通過(guò)調(diào)節(jié)甲狀腺激素的代謝而影響機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝，因此，DIO3是調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育和營(yíng)養(yǎng)代謝的重要調(diào)節(jié)因子。該基因在成人組織中活性很低，且僅表達(dá)于皮膚、子宮和腦等組織[3]，但是在蛻膜組織、胎盤(pán)組織和胎兒組織中表達(dá)量較高[4，5]。

基因組印記是一種基因表達(dá)依賴于其親本來(lái)源的表觀遺傳現(xiàn)象。盡管雙親來(lái)源的兩條染色體具有相同的遺傳序列，但是印記基因只表達(dá)一個(gè)親本來(lái)源的等位基因[6]。DIO3基因位于Dlk1-Dio3印記簇最遠(yuǎn)端，在DLK1基因下游-800 kb處[7]。在小鼠中DIO3基因表現(xiàn)為母本印記、父本表達(dá)[8，9]。本研究采用PCR-RFLP方法分析了豬DIO3基因的印記狀態(tài)，并研究其表達(dá)模式，為進(jìn)一步研究豬印記基因?qū)ωi生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控和功能基因的分子遺傳機(jī)理具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和組織樣品

用于印記分析的樣品：采集自大白豬和梅山豬正反交后代65日齡胚胎（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)豬場(chǎng)）的10個(gè)部位組織（心臟、脾臟、肝臟、腎臟、肺臟、胃、肌肉、小腸、胎盤(pán)和腦），分別提取DNA和RNA。

用于組織表達(dá)譜分析的樣品：采集自65日齡大白豬胚胎（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所原種豬場(chǎng)）的心臟、脾臟、肝臟、腎臟、肺臟、胃、肌肉、脂肪、小腸、子宮等組織，分別提取RNA。

DNA的提取采用傳統(tǒng)的苯酚/氯仿提取法。RNA的提取使用Invitrogen公司的TRIzol試劑盒提取。反轉(zhuǎn)錄主要按照參考文獻(xiàn)[10]中的方法。

1.2 引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增DIO3基因

根據(jù)豬DIO3基因（GenBank accession No. HQ316945）設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增DIO3基因，引物由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

利用DOF/DOR引物，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR，對(duì)豬DIO3基因在65日齡大白豬胚胎的10個(gè)部位不同組織（心臟、脾臟、肝臟、腎臟、肺臟、胃、肌肉、脂肪、小腸和子宮）中的表達(dá)情況進(jìn)行分析。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系為25 μL，模板cDNA 50 ng，正、反向引物SYBR Green Mix 12.5 μL，ddH2O補(bǔ)至25 μL。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)在LightCycler480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行，同時(shí)以β-actinF/β-actinR引物擴(kuò)增β-actin內(nèi)參基因，基因的相對(duì)表達(dá)水平以2-ΔΔCT值表示，數(shù)據(jù)用SPSS16.0軟件進(jìn)行分析，P<0.05表示差異顯著。

1.4 印記分析

用除DNA酶試劑盒處理雜合子個(gè)體的總RNA，然后再反轉(zhuǎn)錄成cDNA。利用引物ACF/ACR在65日齡胚胎的組織DNA水平進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶AcyⅠ酶切，篩選基因型為AC的雜合子個(gè)體，再對(duì)雜合子個(gè)體cDNA水平進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶AcyⅠ酶切，如果cDNA水平只表達(dá)一個(gè)親本的等位基因，另一個(gè)親本的不表達(dá)，則說(shuō)明此基因是印記的。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬DIO3基因組織表達(dá)譜分析

運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)豬DIO3基因在10個(gè)不同組織中的表達(dá)情況進(jìn)行了分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，豬DIO3基因在背部脂肪組織中表達(dá)量最高，其次是肝臟、子宮、腎臟、心臟和小腸組織，在脾臟、肺臟、胃和肌肉組織中表達(dá)量非常低。

2.2 豬DIO3基因多態(tài)性檢測(cè)

為了檢測(cè)外顯子687 bp處的A/C突變（A/C 687），依照DIO3基因序列（HQ316945）設(shè)計(jì)一對(duì)引物ACF/ACR（序列見(jiàn)表1），擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為372 bp，經(jīng)限制性內(nèi)切酶AcyⅠ酶切后，AA基因型為一條372 bp的片段， CC基因型產(chǎn)物為184 bp +188 bp兩條片段，AC基因型為372 bp+184 bp + 188 bp的片段（圖2）。

2.3 豬DIO3基因印記分析

為了檢測(cè)豬DIO3基因印記狀態(tài)，對(duì)大白豬和梅山豬正反交親本和子代的基因組DNA和cDNA進(jìn)行基因分型。在大白豬和梅山豬正交和反交后代65 日齡胚胎中發(fā)現(xiàn)了適合做印記分析的雜合子個(gè)體。用限制性內(nèi)切酶AcyⅠ對(duì)ACF/ACR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行酶切，184 bp 和 188 bp來(lái)自于C等位基因，372 bp來(lái)自于A等位基因（圖2）。印記分析結(jié)果表明DIO3基因在65日齡胚胎組織中呈現(xiàn)出父本表達(dá)、母本印記（圖3）。

3 小結(jié)與討論

研究表明鼠DIO3基因主要表達(dá)于腦、胎盤(pán)、妊娠期子宮和肝臟組織[4，5，11]。本研究中發(fā)現(xiàn)豬DIO3基因在背部脂肪、肝臟和子宮組織中表達(dá)量高，在心臟、腎臟、胃、小腸和肌肉組織中表達(dá)量低，這與前人研究結(jié)果相一致。印記基因?qū)Σ溉閯?dòng)物胚胎的生長(zhǎng)、發(fā)育以及出生后的神經(jīng)發(fā)育和代謝具有重要的影響[12，13]。基因在不同組織中的表達(dá)水平反映了其相應(yīng)的功能，豬DIO3基因在背部脂肪表達(dá)量高，說(shuō)明該基因在控制脂肪分化和調(diào)控脂肪代謝過(guò)程中可能起著重要的作用[14]。豬DIO3基因在子宮中表達(dá)量高，揭示其可能與豬的繁殖性能相關(guān)，為了解調(diào)控豬脂肪沉積和繁殖性能的分子生物學(xué)機(jī)制提供了有價(jià)值的信息。

DIO3基因定位于人染色體的14q32，小鼠染色體的12F1，這些區(qū)域包含眾多的印記基因，該基因在人的皮膚組織以及小鼠的胎兒組織中都表現(xiàn)為父本表達(dá)[15，16]。本研究發(fā)現(xiàn)豬DIO3基因在胚胎發(fā)育的65日齡階段所檢測(cè)的組織中都表現(xiàn)為父本表達(dá)，與人和小鼠的研究結(jié)果一致。這表明在不同物種中DLK1-DIO3區(qū)域的基因組印記具有保守性。

本研究對(duì)豬DIO3基因的組織表達(dá)譜、印記狀態(tài)進(jìn)行了分析，為深入研究印記基因的功能及對(duì)豬生產(chǎn)性狀的影響提供了分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

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