廣林九號桉葉精油的抑菌活性研究

摘要：研究了廣林九號桉[Eucalyptus urophylla×Eucalyptus grandis（Guanglin 9）]葉精油的抑菌活性。利用氣相色譜-質譜聯用技術分析桉葉精油的化學成分，采用濾紙片法評價其抑菌活性，以平板稀釋法測定了精油的最小抑菌濃度。廣林九號桉葉精油的主要成分有：1，8-桉葉油素（40.844%）、α-蒎烯（24.221%）、α-松油醇（4.661%）、反式-松香芹醇（3.735%）、龍腦（2.762%）、乙酸α-松油脂（3.592%）和松香芹酮（1.978%）。廣林九號桉葉精油對測試的菌種均有良好的抑菌活性，但對細菌和霉菌的抑菌效果有所差異。對金黃色葡萄球菌（Staphylococus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli），黃曲霉（Aspergillus flavus）、黑曲霉（Aspergillus niger）和橘青霉（Penicillum citrinum）的最小抑菌濃度分別為10、20、20、10、10、5 mL/L。

關鍵詞：廣林九號桉[Eucalyptus Urophylla×Eucalyptus Grandis（Guanglin 9）]葉；精油；抑菌活性；最小抑菌濃度

中圖分類號：TQ654+.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）21-5193-03

Studies on Antimicrobial Activity of Essential Oil from Leaves of Eucalyptus urophylla × Eucalyptus grandis （Guanglin 9）

TIAN Yu-hong1，ZHOU Qi1，PO Jun-hua2，MENG Lu-li1，LI Zi1

（1. Department of Biological and Chemical Engineering， Guangxi University of Technology，Liuzhou 545006，Guangxi，China；

2. Liuzhou Huali Household Products Limited Company， Liuzhou 545006，Guangxi，China）

Abstract： The antimicrobial activity of the essential oil from leaves of Eucalyptus urophylla×Eucalyptus grandis （Guanglin 9） was studied. The essential oil was analyzed by gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS） method. The antimicrobial activity of oil was evaluated by using filter paper method and the minimum inhibitory concentration（MIC） was determined by plate dilution method. The main components of the essenti-al oil were 1，8-cineole（40.844%）， followed by α-pinene （24.221%）， α-terpineol（4.661%）， α-terpinyl acetate（3.592%）， borneol （2.762%）， trans-pinocarveol （3.735%） and pinocarvone（1.978%）. The results indicated that the essential oil had excellent antimicrobial activity against tested microorganisms. The effects of essential oil on antibacterial and antifungal activities differed obviously. The minimum inhibitory concentrations （MICs） were 10，20，20，10，10 and 5 mL/L for Staphylococus aureus， Bacillus subtilis， Escherichia coli， Aspergillus flavus， Aspergillus niger and Penicillum citrinum， respectively.

Key words： Eucalyptus urophylla × Eucalyptus grandis （Guanglin 9）； essential oil； antimicrobial activity； minimum inhibitory concentration

廣西是國家速生桉商品林基地的主要區域，廣林九號桉[Eucalyptus urophylla×Eucalyptus grandis（Guanglin 9）]是廣西優質速生桉品種，具有速生、干直、耐寒等優良特性，近幾年在廣西得到了大范圍的推廣種植。目前廣林九號桉的作用還只是木材，砍伐后剩余的枝葉僅被簡單地用做燃料，大量的桉葉精油資源被浪費，影響桉樹的綜合經濟效益的提高。桉葉是中國南方常用的中草藥，桉葉油具有抗菌、抗炎、抗氧化和局部麻醉等作用，可用于治療流行性感冒、上呼吸道感染、肺炎、咳嗽及皮膚疾病[1-4]。目前有關廣林九號桉葉精油的生物活性的研究還鮮見報道，本試驗對廣林九號桉葉精油的抑菌活性進行了研究，為科學開發利用廣林九號桉葉提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 廣林九號桉葉樣品于2011年2月采自廣西國營沙塘林場，隨機在10～15棵廣林九號桉樹上采集葉片樣品，將樣品置于陰涼處風干后備用。

1.1.2 菌種 金黃色葡萄球菌（Staphylococus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli），黃曲霉（Aspergillus flavus）、黑曲霉（Aspergillus niger）和橘青霉（Penicillum citrinum），由廣西工學院生物與化學工程系微生物實驗室提供。

1.1.3 儀器 6890GC/5973MS型氣相色譜-質譜聯用儀（美國安捷倫科技公司），LRH-250-Ⅱ型全自動新型生化培養箱（廣東省醫療器械廠），SW-CJ-1B型標準型凈化工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司），DMB5型Motic數碼顯微鏡（麥克奧迪實業有限公司），HZ-9212S型恒溫培養振蕩器（太倉市科教器材廠），628B-2型立式壓力蒸汽消毒器（遼寧省鐵嶺市醫療器械總廠）。

1.2 方法

1.2.1 廣林九號桉葉精油的提取 將風干的桉葉葉片切成1～2 cm2的碎片，稱取100 g上述樣品置于揮發油提取器中按常規水蒸氣蒸餾法提取6 h，靜置分層后讀取揮發油的體積，所得廣林九號桉葉油為具有濃郁特殊嗅味的淡黃綠色油狀物。

1.2.2 氣相色譜-質譜工作條件

1）氣相色譜條件。毛細管色譜柱HP-5MS（30 m ×0.25 mm×0.25 μm）。升溫程序為60 ℃保持1 min，以2 ℃/min的升溫速度升至170 ℃，再以8 ℃/min的升溫速度升至270 ℃，270 ℃保持5 min。載氣為高純氦氣。進樣口溫度280 ℃，檢測器溫度230 ℃，分流比100∶1。

2）質譜條件。EI電離源，電子能量70 eV，電子倍增器電壓1.5 kV， 質量掃描范圍33～550 amu，全掃描方式。

1.2.3 廣林九號桉葉精油的抑菌活性研究

1）抑菌活性的測定。采用濾紙片法測定廣林九號桉葉精油的抑菌活性[5，6]。取吸水力較強且質地均勻的濾紙，用打孔器打成直徑6 mm的圓形濾紙片，置潔凈干燥的培養皿中，干熱滅菌后備用。吸取0.2 mL已稀釋到一定濃度的各種菌液（細菌為108 CFU/mL，霉菌為106 CFU/mL），將其均勻地涂布于固體平板培養基表面，細菌為營養瓊脂培養基（NA），霉菌為PDA培養基。將一片滅過菌的濾紙片放于含菌平板上，再吸取10 μL廣林九號桉葉精油垂直加到濾紙片上。細菌在37 ℃恒溫培養24 h，霉菌在28 ℃恒溫培養48 h，觀察抑菌情況，并測量抑菌圈直徑。以常用抗生素（細菌用1.0 mg/mL的阿莫西林溶液，霉菌用0.27 mg/mL的克霉唑溶液）作為陽性對照。每個樣品做3個平行樣，并重復2次。取試驗結果的平均值作為最終結果。

2）最小抑菌濃度的測定。采用平板連續稀釋法[7，8]。用經滅菌處理的1% Tween 80 去離子水溶液，將待測精油配成不同濃度的藥液。將藥液與培養基（細菌為NA培養基，霉菌為PDA培養基）充分混勻后取15 mL加入無菌培養皿中，得到含精油濃度分別為80.000、40.000、20.000、10.000、5.000、2.500、1.250、0.625 mL/L的培養基。吸取制備好的菌懸液或孢子懸液0.1 mL，將其均勻涂布于上述平板表面，置于一定溫度（細菌37 ℃、霉菌28 ℃）下，培養一定時間（細菌培養24 h，霉菌培養48 h）后，觀察供試菌的生長情況。以完全沒有菌生長的精油濃度作為最小抑菌濃度。以常用抗生素（細菌用阿莫西林，霉菌用克霉唑）作為陽性對照，3次重復。

2 結果與分析

2.1 廣林九號桉葉精油化學成分

廣林九號桉陰干葉的精油提取率為0.52 mL/100 g。對廣林九號桉葉精油進行成分分析，采用計算機對各峰質譜圖進行NIST標準譜庫檢索，根據質譜裂解規律進行核對，參考標準圖譜及相關文獻確定其化學結構[3，9]。利用峰面積歸一法計算各組分的相對百分含量，經鑒定確認了56個化學成分，占總離子流出峰面積的94.378%。廣林九號桉葉精油化學成分見表1。由表1可知，廣林九號桉葉精油主要成分為1，8-桉葉油素（40.844%）、α-蒎烯（24.221%）、α-松油醇（4.661%）、反式-松香芹醇（3.735%）、乙酸α-松油脂（3.592%）、龍腦（2.762%）、松香芹酮（1.978%）、莰烯（1.164%）、α-龍腦烯醛（1.112%）、葑醇（1.104%）、斯巴醇（1.054%）和藍桉醇（1.036%）。

2.2 廣林九號桉葉精油的抑菌活性

廣林九號桉葉精油對供試菌種的抑菌圈直徑參見表2。由表2可知，廣林九號桉葉精油對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、黃曲霉、黑曲霉和橘青霉均有較好的抑制作用。精油對上述供試菌抑菌圈的大小依次為16.8、13.0、9.5、9.7、11.7和17.5 mm。

2.3 廣林九號桉葉精油的最小抑菌濃度

采用平均連續稀釋法測定了廣林九號桉葉精油對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、黃曲霉、黑曲霉和橘青霉的最小抑菌濃度，結果見表3。從表3可以看出，廣林九號桉葉精油對細菌和霉菌的抑菌效果有差異。對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌3種細菌的最小抑菌濃度為10～20 mL/L，其中對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強，最小抑菌濃度為10 mL/L。對黃曲霉、黑曲霉和橘青霉3種霉菌的最小抑菌濃度為5～10 mL/L，精油對橘青霉抑制作用最強，最小抑菌濃度為5 mL/L。

3 小結

廣林九號桉葉精油主要成分為1，8-桉葉油素（40.844%）、α-蒎烯（24.221%）、α-松油醇（4.661%）、反式-松香芹醇（3.735%）、乙酸α-松油脂（3.592%）、龍腦（2.762%）、松香芹酮（1.978%）、莰烯（1.164%）、α-龍腦烯醛（1.112%）、葑醇（1.104%）、斯巴醇（1.054%）和藍桉醇（1.036%）。

抑菌活性研究表明，廣林九號桉葉精油對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、黃曲霉、黑曲霉和橘青霉均具有抑菌活性，其對霉菌的抑制效果要強于對細菌的抑制效果。廣林九號桉葉精油在醫藥、食品及日化工業具有一定的應用開發潛力。

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