歐文氏桿菌鐵代謝相關基因的生物信息學分析

摘要：利用生物信息學軟件對歐文氏桿菌（Erwinia carotovora subsp. atroseptica）基因組中與鐵代謝相關的基因進行生物信息學分析。結果表明，共篩選到71個與鐵代謝相關的基因，其中，有51個為已知功能基因，20個為推測功能基因。在獲得的71個基因中，12個基因參與鐵載體合成、27個基因與Fe3+吸收有關、3個基因與Fe2+吸收有關、10個基因與亞鐵血紅素吸收有關、1個基因與編碼貯鐵蛋白有關、7個基因與鐵吸收調控有關、還有11個基因可能與鐵代謝有關。

關鍵詞：歐文氏桿菌（Erwinia carotovora subsp. atroseptica）；鐵代謝相關基因；生物信息學分析

中圖分類號：S432.4+2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）22-5606-03

隨著生物信息學的發展，利用生物信息學方法研究生命現象與機制已成為新的研究熱點。軟腐病菌中的歐文氏桿菌（Erwinia carotovora subsp. atroseptica）SCRI1043的全基因組序列已公布[1-3]。本研究運用生物信息學方法篩選歐文氏桿菌基因組中與鐵代謝有關的基因，并進行相關分析，為控制軟腐病的發生提供理論依據。

1 材料與方法

根據NCBI數據庫中歐文氏桿菌SCRI1043（以下簡稱Eca1043）的基因組，將Eca1043的基因組中每一個編碼序列Coding sequence（CDS）利用DNAMAN軟件轉化為FASTA蛋白的格式，與NCBI數據庫中公布的28個完全注解的腸桿菌科細菌的CDS進行BLAST比對，找出該菌株中所有與鐵代謝相關的基因，并使用DNAStar和TreeView軟件對其進行同源性分析。

2 結果與分析

Eca1043菌株的基因組大小為5 064 019 nt，G+C含量為50.97%，4 614個已預測的CDS，其中有20個假基因，7個rRNA操縱子，76個tRNA。通過與28個完全注解腸桿菌科細菌的全部CDS進行BLAST比對，發現了71個與鐵代謝相關的基因，其中包括12個參與鐵載體合成的基因，27個基因與Fe3+吸收相關的基因，3個與Fe2+吸收相關的基因，10個與亞鐵血紅素吸收相關的基因，1個與貯鐵蛋白相關的基因，7個與鐵調控相關的基因，11個其他可能與鐵代謝相關的基因。

2.1 鐵載體生物合成系統

通過序列比對，Eca1043菌株中與鐵代謝相關基因與大腸桿菌（Escherichia coli）中某些基因具有較高的相似性，ECA0475、ECA0474、ECA0477、

ECA0478、ECA0479、ECA0480、ECA0481、ECA2023、ECA3781、ECA4116基因與腸菌科中大腸桿菌中cirA、entD、entC、entE、entB、entF、entA、iucC、fepA、 iucC基因的氨基酸序列相似性分別為36.61%、32.53%、46.30%、64.63%、62.94%、30.30%、60.32%、29.47%、63.71%、29.47%。ECA0731、ECA3985基因的氨基酸序列與假結核耶爾森氏菌（Yersinia pseudotuberculosis）基因的氨基酸序列相似性分別為58.60%、74.36%。由于大腸桿菌中entD、entC、entE、entB、entF、entA基因編碼的蛋白與鐵載體的生物合成有關[4]，推測Eca1043菌株中的ECA0475、ECA0474、ECA0477、ECA0478、ECA0479、ECA0480、ECA0481基因也應該與歐文氏桿菌鐵載體生物合成相關。

2.2 Fe3+轉運系統相關基因

在Eca1043菌株的基因組中發現12個Fe3+-鐵載體轉運子，其中包括Fe3+轉運子、Fe3+ ABC轉運子、鐵色素轉運子、Fe3+-二檸檬酸鹽轉運子。12個Fe3+-鐵載體轉運子中有4個操縱子包括11個基因（ECA1492—ECA1494，ECA2561—ECA2564、ECA3243、

ECA4254—ECA4256）編碼Fe3+ ABC轉運相關蛋白，有1個操縱子包括3個基因（ECA3310—ECA3312）編碼鐵色素轉運相關蛋白，有1個操縱子包括6個基因（ECA1073—ECA1078）編碼Fe3+-二檸檬酸鹽轉運相關蛋白，有1個操縱子包括2個基因（ECA3138—ECA3139）編碼Fe3+轉運相關蛋白，還有5個操縱子包括5個基因（ECA0350、ECA0814、ECA1510、ECA1775、ECA2718）尚無法確定具體功能。

2.3 Fe2+轉運系統相關基因

細菌中Fe2+吸收與Fe3+吸收是同等重要的[5]。在Eca1043菌株的基因組中，不但發現了與Fe3+轉運系統相關基因，還發現了3個與Fe2+轉運蛋白相關的基因ECA3277、ECA3933、ECA4308，并與大腸桿菌的Fe2+轉運系統相關基因feoB、fieF同源性很高。

2.4 亞鐵血紅素吸收系統相關基因

大多數細菌在生長階段需要鐵，而在侵染階段則需要亞鐵血紅素[5-7]，所有已被證實的能使亞鐵血紅素降解的酶都是單加氧酶作為亞鐵血紅素的加氧酶。目前，已證實在金黃葡萄球菌（Staphylococcus aureus）中的亞鐵血紅素的吸收系統蛋白是由一簇isd（Iron-regulated surface determinants）基因編碼的[8]。在Eca1043菌株的基因組中發現了10個與亞鐵血紅素吸收相關的基因，其中8個基因功能已知，還有2個基因功能為預測的。ECA1882—ECA1885與大腸桿菌中與亞鐵血紅素的轉運相關基因ccmA、ccmB、ccmC、ccmD具有高度的相似性，ECA2116—ECA2118與假結核菌中和溶血素蛋白相關的基因YPTB3461、YPTB3460、YPTB3459具有高度相似性。此外，ECA0056、ECA1537、ECA1538與假結核菌中與亞鐵血紅素的轉運相關基因hmuR、hasA、hasR具有高度相似性。

2.5 鐵吸收調節蛋白相關基因（Fur）及其同系物

Fur是鐵吸收相關基因的重要調節子，在細菌的生長和侵染過程中起著重要作用。與鐵吸收相關的大多數基因中都有一個保守的上游Fur結合位點（Fur-Box），在鐵充足的條件下，Fur蛋白結合Fe2+，然后結合到Fur-Box上，導致Fur調控基因的轉錄受阻。Fur蛋白根據胞內鐵的有效濃度來調節細菌的鐵代謝，除Fur基因外，還發現了與Fur基因功能相近的6個基因，1個是zur基因（ECA0632），編碼依賴鋅的阻遏物；1個編碼鐵蛋白的基因（ECA2473）和4個其他與Fur基因功能相近的基因（ECA1941、ECA3778、ECA3833、ECA3834），均與大腸桿菌中的相應基因具有很高的相似性。

Fe2+-Fur復合物通常結合在被抑制基因啟動子之間，最初發現Fur結合位點與己知的Fur-box的19 bp回文序列（GATAATGATAATCATTATC）相一致[9]。在大腸桿菌染色體的任何位置都沒有發現這種嚴格的序列，Fur結合位點可能只匹配一致序列的11/19堿基，如TonB[10]。本研究利用Fur-box的19 bp的回文序列找到了26個推測的Fur-box，這些基因參與了鐵載體的生物合成以及鐵的吸收、轉運、儲存和調控。

2.6 貯鐵蛋白相關基因及其他與鐵吸收相關基因

鐵蛋白是在細菌細胞中發現的貯鐵蛋白的一類，為中空的球形粒子形態，其中貯存2 000到4 500個三價鐵原子。鐵蛋白的粒子直徑大約在8～12 nm，為調節鐵進出細胞內部的運輸通道。細菌中有兩種形式的鐵蛋白，一種是含有亞鐵血紅素的鐵蛋白，另一種是不含亞鐵血紅素的鐵蛋白。鐵蛋白在革蘭氏陰性菌中的主要作用是貯鐵，以及防止金屬毒性和氧化，在不同的菌株中鐵蛋白的調控和功能顯著不同[11]。在Eca1043中發現了一個編碼鐵蛋白的基因ECA2473（表1）與大腸桿菌中編碼鐵蛋白的基因ftn同源性很高。

除了以上與貯鐵蛋白相關的基因外，還找到了可能與鐵吸收相關的11個基因，其中有9個基因為已知功能的基因，2個基因為預測功能的基因。5個基因（ECA1197、ECA1898、ECA3232、ECA3273、ECA4269）與大腸桿菌中與鐵氧還蛋白相關的基因（yfaE、napF、fdx、yfhL、ECs4849）具有很高相似性，6個基因（ECA1181、ECA2392—ECA2395、ECA2395）與大腸桿菌中與鐵螯合蛋白相關基因（hemH、sitA、SitB、sitC、SitD、c2517）具有很高的同源性。

3 小結與討論

基因組序列測定使微生物研究手段發生了革命性改進。自1995年嗜血流感菌（Haemophilus influenza）基因組序列發表以來，已有312種細菌基因組全序列完成測序（http//www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/MICROBES/Complete.html），包括26種古細菌，286種真細菌。截至2013年9月，收錄在GenBank已測基因組全序列的植物病原細菌種類達31種，依靠傳統的研究思想和試驗手段注釋如此龐大的生物信息資源幾乎是不可能的。生物信息學的首要任務之一是分析新基因的功能，即從大量不連續的信息中發現其中隱藏著的重要信息。

通過多重序列比對篩選保守序列是生物信息學方法的基礎，幾乎所有的注釋序列的意義、研究序列結構的方法都是建立在此基礎上的。保守序列是指病毒在進化過程中基因組序列保持不變或變異很小的序列。在進化過程中，變化很小或者不變的序列往往承擔著極其重要的功能，一旦出現變化，功能就會受影響或者被破壞，物種就有被淘汰的危險。因此，保持不變或變化很小的序列可能具有相同的功能。國際上已有專門的數據庫（如Blocks、PROSITE和IDENTIFY）和分析軟件（如BLAST、DNAsis、FASTA、GCG、MOST、Emotif和Tool）用于保守序列的分析。

本研究利用生物信息學方法對歐文氏桿菌基因組進行分析，發現了71個與鐵代謝相關的基因，分別參與了歐文氏桿菌中鐵載體的生物合成以及鐵的運輸、吸收、貯存和調控。

參考文獻：

[1] BULTREYS A， GHEYSEN I， MARAITE H， et al. Characterization of fluorescent and non-fluorescent peptide siderophores produced by Pseudomonas syringae strains and their potential use in strain identification[J]. Applied and Environmental Microbiology，2001，67（4）：1718-1727.

[2] DERBYSHIRE P， BALDWIN T， STEVENSON P， et al. Expression in Escherichia coli K-12 of the 76， 000-dalton iron-regulated outer membrane protein of Shigella flexneri confers sensitivity to cloacin DF13 in the absence of Shigella O antigen[J]. Infection Immunity，1989，57（9）：2794-2798.

[3] BELL M， SEBAIHIA L， PRITCHARD，et al. Genome sequence of the enterobacterial phytopathogen Erwinia carotovora subsp. atroseptica and characterization of virulence factors[J]. Proceedings of the National Academy of Science of the United State of America，2004，101（30）：11105-11110.

[4] RAYMOND K N， EMILY A， DERTZ， et al. Enterobactin： An archetype for microbial iron transport[J]. Proceedings of the National Academy of Science of the United State of America，2003，100（7）：3584-3588.

[5] VELAYUDHAN J， HUGHES N J， MCCOLM A A， et al. Iron acquisition and virulence in Helicobacter pylori： a major role for FeoB， a high-affinity ferrous iron transporter[J]. Journal of Molecular Biology，2000，37（2）：274-286.

[6] LILLARDJR J W， BEARDEN S W ， FETHERSTON J D， et al. The haemin storage （Hms+） phenotype of Yersinia pestis is not essential for the pathogenesis of bubonic plague in mammals[J].Microbiology，1999，145（1）：197-209.

[7] PERRY R D，SHAH J， BEARDEN S W， et al. Yersinia pestis TonB： role in iron， heme， and hemoprotein utilization[J]. Infection and Immunity，2003，71（7）：4159-4162.

[8] MAZMANIAN S K， SKAAR E P， GASPAR A H， et al. Passage of heme-iron across the envelope of Staphylococcus aureus[J]. Science，2003，299（5608）：906-909.

[9] MORRISSEY J A， COCKAYNE A， BRUMMELL K， et al. The staphylococcal ferritins are differentially regulated in response to iron and manganese and via PerR and Fur[J]. Infection and Immunity，2004，72（2）：972-979.

[10] ESCOLAR L， PEREZ-MARTIN J， LORENZO D V J. Evidence of an unusually long operator for the Fur repressor in the aerobactin promoter of Escherichia coli[J]. Journal of Biological Chemistry，2000，275（32）：24709-24714.

[11] NEWMAN D L， SHAPIRO J A. Differential fiu-lacZ fusion regulation linked to Escherichia coli colony development[J]. Molecular Microbiology，1999，33（1）：18-32.

（責任編輯 屠 晶）