湖北建始丹皮HPLC指紋圖譜研究

摘要：為了建立湖北省建始縣丹皮的高效液相色譜指紋圖譜，并為科學(xué)評(píng)價(jià)及有效控制其質(zhì)量提供可靠方法。采用C18色譜柱，甲醇-水梯度洗脫，流速1.0 mL/min，檢測波長242 nm，柱溫25 ℃。對(duì)建始丹皮10批次藥材進(jìn)行指紋圖譜分析，通過HPLC技術(shù)指認(rèn)指紋圖譜共有12個(gè)共有峰，相似度0.926～0.995。結(jié)果表明，該方法具有較好的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，10個(gè)批次的丹皮樣品生成的指紋圖譜可作為建始丹皮的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。

關(guān)鍵詞：丹皮；高效液相色譜法；指紋圖譜

中圖分類號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）22-5521-03

丹皮屬毛莨科（Ranunculaceae）植物牡丹（Paeonia suffruticosa）的根皮[1，2]，《本草綱目》：“滋陰降火，解斑毒，利咽喉，通小便血滯”。現(xiàn)代研究表明，丹皮酚有鎮(zhèn)靜、降溫、解熱、鎮(zhèn)痛、解痙等中樞抑制作用和抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用[3，4]，可用于治療闌尾炎初起、吐血、跌打損傷等[5，6]。湖北省建始縣處于武陵山區(qū)，春有梅雨，夏伏旱較長，冬季雨量較少，適宜中藥材的生長。20世紀(jì)80年代末期開始種植牡丹，現(xiàn)種植面積達(dá)200多hm2。目前，丹皮主要有高效液相色譜法[7，8]、高效液相色譜-質(zhì)譜法[9]和高效毛細(xì)管電泳色譜法[10]等分析方法。本試驗(yàn)著重研究建始丹皮的HPLC指紋圖譜，為丹皮藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供重要的參考指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料

U3000型戴安液相色譜儀；KQ-250D型超聲波清洗器；丹皮酚對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)20120210），色譜乙腈，去離子水，甲醇等試劑均為分析純。丹皮樣品來源見表1。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 依利特色譜柱C18（4.6 mm×200 mm，5 μm），流動(dòng)相甲醇-水連續(xù)梯度，柱溫25 ℃，檢測波長242 nm，流速1.0 mL/min。

1.2.2 丹皮酚對(duì)照品溶液的制備 取丹皮酚對(duì)照品適量，用甲醇分別配制成含丹皮酚100 μg/mL的對(duì)照品溶液。丹皮酚對(duì)照品HPLC指紋圖譜見圖1。

1.2.3 供試品的制備 精密稱取丹皮藥材粉末（過30目篩）約0.5 g，置于錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量。超聲提取30 min后冷至室溫，稱質(zhì)量，補(bǔ)足減失質(zhì)量。用0.45 μm濾膜過濾即得。

1.2.4 10個(gè)批次丹皮HPLC指紋圖譜建立 精密吸取對(duì)照品和供試品溶液，按照1.2.1色譜條件進(jìn)行測定。10個(gè)批次的丹皮HPLC指紋圖譜見圖2。

2 結(jié)果與分析

2.1 精密度試驗(yàn)

按照“1.2.1”的色譜條件連續(xù)進(jìn)同一供試品溶液5次，考察色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的一致性。結(jié)果表明，12個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.03%～0.50%，主要色譜峰的相對(duì)峰面積RSD為0.63%～1.84%。

2.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，按每隔2 h測定一次，考察色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的一致性。結(jié)果表明，12個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和主要色譜峰的相對(duì)峰面積基本一致，RSD分別為0.42%～0.69%、0.65%～1.43%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取丹皮藥材5份，按照“1.2.3”的方法平行制備5份供試品，考察色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的一致性。結(jié)果表明，12個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間和主要色譜峰相對(duì)峰面積基本一致，RSD分別為0.49%～0.57%、0.51%～1.59%，證明該方法的重復(fù)性較好。

2.4 共有峰的確定

取表1中的10個(gè)批次丹皮藥材，按“1.2.3”的方法制備供試品溶液進(jìn)樣、測定。比較其色譜圖，得到12個(gè)共有峰，以丹皮酚的色譜峰（共有峰-7）為參照峰（相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積分別為1.00和1.000 0），計(jì)算色譜圖中各共有峰的相對(duì)保時(shí)間和相對(duì)峰面積，見表2、表3。由表2、表3可知，10個(gè)批次丹皮藥材的相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.25%～0.53%，表明樣品各共有峰之間的重合性好。相對(duì)保留峰面積RSD在11.06%～24.52%，不同批次丹皮藥材各成分含量有所差異。

2.5 相似度的計(jì)算

根據(jù)國家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》2004年A版進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。選取色譜圖中的12個(gè)共有峰，以10個(gè)批次丹皮藥材的相對(duì)峰面積的均值作為對(duì)照模板，由中藥色譜圖分析和數(shù)據(jù)管理軟件自動(dòng)進(jìn)行峰匹配，確定12個(gè)共有峰。利用相關(guān)系數(shù)法計(jì)算指紋圖譜的相似度，結(jié)果見表4。由表4可知，10批次丹皮藥材的相似度在0.926～0.995之間，相似度較高。

3 小結(jié)與討論

1）建立了建始丹皮的HPLC指紋圖譜方法，通過對(duì)其柱效、分離度及方法學(xué)的考察，證明了所選的色譜系統(tǒng)適應(yīng)性較好，能較好地反應(yīng)建始丹皮中的色譜峰特征。

2）對(duì)色譜條件進(jìn)行了摸索，通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，波長在242 nm處，除丹皮酚的吸收較強(qiáng)外，還有幾個(gè)共有峰的吸收也很強(qiáng)，且雜質(zhì)較少。可以用甲醇-水作為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫，能有效將各個(gè)色譜峰分離開來。

3）對(duì)比色譜圖，確認(rèn)10批次丹皮藥材有12個(gè)共有峰，以共有峰-7作為參照峰，并計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)保留峰面積。相對(duì)保留時(shí)間的RSD在2%以內(nèi)，表明10批次的樣品共有峰重合性較好，方法穩(wěn)定。共有峰相對(duì)峰面積RSD在11.06%～24.52%，10批次之間各成分含量有差別，原因可能與土壤類型、海拔高度，栽培技術(shù)及后期管理等有關(guān)。

4）用衛(wèi)生部藥典委員會(huì)頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2004版）軟件對(duì)丹皮指紋圖譜進(jìn)行相似度計(jì)算。結(jié)果表明，以10個(gè)批次丹皮藥材的相對(duì)峰面積的均值作為對(duì)照模板，相似度在0.926～0.995之間，相似度較高。

本試驗(yàn)采用HPLC法，建立建始丹皮的HPLC指紋圖譜，有效地反映和衡量了建始丹皮藥材的化學(xué)成分，能應(yīng)用到建始丹皮的鑒定和質(zhì)量評(píng)價(jià)中。運(yùn)用相似度的計(jì)算，為丹皮的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

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（責(zé)任編輯 童志婷）