假絲酵母高產(chǎn)SOD菌株的篩選

摘要：超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，EC1.15.1.1，簡(jiǎn)稱(chēng)SOD）是廣泛存在于生物體的一種十分重要的金屬酶，因其對(duì)機(jī)體所具有的較高防護(hù)與保健價(jià)值而深受人們的關(guān)注。目前SOD主要來(lái)源于動(dòng)物血液，資源有限。試驗(yàn)從微生物中提取SOD，通過(guò)分離、鑒定為假絲酵母（Candida glaebosa）。對(duì)假絲酵母的四個(gè)生長(zhǎng)條件，即生長(zhǎng)溫度、接種量、初糖濃度和培養(yǎng)基的pH進(jìn)行優(yōu)化，從而得出產(chǎn)SOD的最優(yōu)生長(zhǎng)條件，即菌種在初糖濃度為50 g/L，pH為5.8的培養(yǎng)基中，接種3 mL，在26 ℃生長(zhǎng)3 d所得的菌體具有最高的產(chǎn)SOD能力。

關(guān)鍵詞：假絲酵母（Candida glaebosa）；高產(chǎn)；SOD；篩選

中圖分類(lèi)號(hào)：Q939.97 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）22-5466-04

超氧化物歧化酶（SOD）是廣泛存在于生物體內(nèi)，具有防御氧化損傷（抗氧化）作用的一類(lèi)金屬酶[1]。研究表明，從微生物中提取主要得到Fe-SOD，Mn-SOD，但有的微生物含有不同類(lèi)型SOD，如酵母菌既有Cu/Zn-SOD，又含有Mn-SOD；大腸桿菌則含有3種SOD[2]。目前SOD臨床上主要用于治療糖尿病、白內(nèi)障、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性多發(fā)性關(guān)節(jié)炎，而且還能抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤、抗輻射、抗自身免疫疾病，是很有臨床價(jià)值的藥用酶。此外，SOD對(duì)治療貝切特氏病、心肌梗塞等血管性心臟病、膠原病、新生兒呼吸困難綜合征、水腫、肺氣腫、輻射病以及老年白內(nèi)障等疾病也有療效[3]。在中國(guó)，SOD研究和應(yīng)用的深度及廣度早幾年前就已居酶類(lèi)生化制劑的首位[4]。

近幾年來(lái)國(guó)內(nèi)外在微生物SOD的菌種選育、發(fā)酵工藝、生理學(xué)機(jī)理、基因重組的研究及SOD的應(yīng)用方面都獲得了一定的進(jìn)展。由于純化SOD的工藝十分的復(fù)雜，成本較高，而用有益微生物發(fā)酵生產(chǎn)的SOD有可能不經(jīng)過(guò)傳統(tǒng)的純化工藝直接用于食品及化妝品，還可以直接用于乳制品發(fā)酵，生產(chǎn)功能性食品及微生物制劑。因此，隨著微生物SOD的研究及SOD應(yīng)用基礎(chǔ)研究的進(jìn)一步深入，其在醫(yī)療保健、食品、化妝品等方面會(huì)有更加廣泛的應(yīng)用。酵母菌作為生產(chǎn)SOD的材料來(lái)源之一，具有繁殖快，代謝時(shí)間短，產(chǎn)率高，易培養(yǎng)，易大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，不受季節(jié)與自然條件的限制等優(yōu)點(diǎn)[5]。本試驗(yàn)研究了從假絲酵母（Candida glaebosa）中篩選高產(chǎn)SOD菌株的方法，以期為實(shí)現(xiàn)微生物法生產(chǎn)SOD提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

實(shí)驗(yàn)菌種從華中農(nóng)業(yè)大學(xué)菊?qǐng)@、葡萄園、梔子花園中采集土樣，通過(guò)分離獲得。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 酵母富集液 葡萄糖 5%，尿素0.1%，（NH4）2SO4 0.1%，KH2PO4 0.25%，Na2HPO4 0.05%，MgSO4·7H2O 0.1%，F(xiàn)eSO4·H2O 0.01%，酵母膏0.05%，孟加拉紅0.003%，pH 4.5。

1.2.2 氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基 KH2PO4 1.36 g，CaCl2·2H2O 0.005 g，Na2HPO4 2.13 g，MgSO4 ·7H2O 0.2 g，F(xiàn)eSO4·H2O 0.2 g，葡萄糖10 g，蒸餾水1 000 mL。

1.2.3 碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基 （NH4）2SO4 2 g，MgSO4 ·7H2O 0.2 g，NaH2PO4 0.5 g，CaCl2·2H2O 0.1 g，KH2PO4 0.5 g，蒸餾水1 000 mL。

以上3種培養(yǎng)基均用蒸餾水配制，然后121 ℃滅菌20 min。

1.2.4 發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基 配料：黃豆芽200 g，水1 000 mL；制法：將豆芽洗凈，放入水中煮沸30 min，用紗布過(guò)濾。

1.2.5 馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（固體另加1.5%～2.0%的瓊脂） 配料：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，自來(lái)水1 000 mL，pH自然；制法：馬鈴薯去皮，切成小塊，加水煮軟，用紗布過(guò)濾后加入糖和瓊脂，融化后補(bǔ)足水分，然后在121 ℃下滅菌20 min。

1.3 儀器與藥品

1.3.1 儀器 Leica DME顯微系統(tǒng)，上海萊卡顯微系統(tǒng)有限公司；恒溫?fù)u床、超凈工作臺(tái)，哈爾濱市東聯(lián)公司；臥式圓形壓力蒸汽滅菌鍋，上海華成醫(yī)用核子儀器有限公司；調(diào)速多用振蕩器，國(guó)華電器有限公司；UV-754型分光光度計(jì)，蘇州江東精密儀器有限公司；ESJ60-4型電子分析天平，沈陽(yáng)天平儀器有限公司。

1.3.2 藥品 葡萄糖、D-木糖、乳糖、鼠李糖、麥芽糖、棉子糖、半乳糖、蔗糖、L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖、山梨醇、甘露醇、異丙醇均為分析純，上海化學(xué)試劑總廠；磷酸氫二鉀，分析純，天津市北聯(lián)化學(xué)試劑廠；硝酸鉀，分析純，廣東西隴化工廠；孟加拉紅，Tris為生化試劑，常州興慧化工有限公司；鄰苯三酚，化學(xué)純，貴州遵義市第二化工廠。

1.4 方法

1.4.1 菌種的分離與鑒定

1）分離方法。本試驗(yàn)采集四種樣品，即菊?qǐng)@土、菊花花瓣、梔子花園土、葡萄園土，取適量在酵母富集液中培養(yǎng)，富集酵母菌，然后用接種環(huán)蘸取少量菌體在馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基上劃線分離，并通過(guò)多次劃線進(jìn)行純化，然后在斜面上保存菌種，放入冷藏室備用。

2）鑒定方法。從形態(tài)學(xué)特征和生理生化特征兩個(gè)方面進(jìn)行鑒定[6]。

1.4.2 培養(yǎng)及測(cè)活

1）培養(yǎng)方法。試驗(yàn)采用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，先把菌種在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，使菌體生長(zhǎng)旺盛，即每毫升菌懸液中含有107個(gè)細(xì)胞。然后把活化菌液接種至100 mL的馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，在恒溫?fù)u床上培養(yǎng)3 d。

2）生物量測(cè)定。培養(yǎng)結(jié)束后，將菌體移入離心管中，3 000 r/min離心20 min，水洗菌體2次，再離心10 min，收集細(xì)胞并稱(chēng)取質(zhì)量，即為菌體生物量。

3）SOD粗酶液的制備。采用異丙醇提取方法提取假絲酵母中的SOD[7]。先將預(yù)處理過(guò)的酵母泥加入異丙醇（異丙醇∶酵母泥體積比為9∶1），浸泡120 min，抽濾出異丙醇。再加入3倍體積的50 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH 7.0），攪拌120 min，離心除去菌體，即得SOD粗酶液[8]。

4）SOD活性的測(cè)定。采用微量鄰苯三酚自養(yǎng)化法[9]進(jìn)行測(cè)定。

1.4.3 假絲酵母產(chǎn)SOD培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1）單因素試驗(yàn)。

初糖濃度：先配制不添加葡萄糖的馬鈴薯培養(yǎng)基，在121 ℃滅菌20 min，分別按30、50、70、90 g/L加入葡萄糖，接種2 mL活化菌懸液，在28 ℃培養(yǎng)3 d，測(cè)定其生物量和SOD活性。

接種量：把活化的菌種分別按1、2、3、4、5 mL的量接入100 mL馬鈴薯液體培養(yǎng)基中，在28 ℃培養(yǎng)3 d，測(cè)定其生物量和SOD活性。

溫度：把接種后的培養(yǎng)液分別放入25、26、27、28、29、30 ℃的恒溫?fù)u床上培養(yǎng)3 d，測(cè)定其生物量和SOD活性。

pH：把配制好的培養(yǎng)基用檸檬酸鹽-磷酸緩沖液調(diào)節(jié)pH至5.0、5.2、5.4、5.8、6.2、6.6、7.0，在121 ℃滅菌20 min，接種，28 ℃培養(yǎng)3 d，測(cè)定其生物量和SOD活性。

2）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。通過(guò)分析單因素試驗(yàn)的數(shù)據(jù)和變化曲線，確定出正交試驗(yàn)的因素與水平，如表1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種鑒定結(jié)果

2.1.1 初篩菌株 從四種原料中分離出來(lái)的菌種，分別在馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d，染色觀察。通過(guò)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察，初步確定只有菊?qǐng)@土中分離出的有可能是假絲酵母，其菌落表面光滑濕潤(rùn)，四周較為平整，菌落較大。鏡檢細(xì)胞形態(tài)如圖1所示，細(xì)胞進(jìn)行出芽生殖，并且形成了明顯的假菌絲，初步確定其屬于假絲酵母屬。其他幾株菌是細(xì)菌或酵母菌，沒(méi)有假菌絲。

2.1.2 菌種的鑒定 生化試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌在鼠李糖、棉子糖、D-木糖、麥芽糖、D-阿拉伯糖、D-半乳糖，葡萄糖、乳糖、蔗糖中均不能發(fā)酵，在山梨醇和木糖醇中也不能發(fā)酵。同化試驗(yàn)可知，該菌可利用硝酸鉀，在木糖中生長(zhǎng)最好，在葡萄糖、麥芽糖、L-半乳糖、棉子糖中生長(zhǎng)良好，在D-阿拉伯糖中微量生長(zhǎng)，在鼠李糖和L-阿拉伯糖中不能生長(zhǎng)。通過(guò)查酵母菌鑒定檢索表，得知該菌是團(tuán)假絲酵母。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 培養(yǎng)溫度 由圖2可知，培養(yǎng)溫度在28 ℃時(shí)其SOD活力最高，當(dāng)培養(yǎng)溫度小于28 ℃時(shí)，隨著培養(yǎng)溫度的上升，SOD活性不斷增大；培養(yǎng)大于28 ℃時(shí)，SOD活性逐漸變小，這可能是因?yàn)樵摼谳^高溫度或較低溫度下生長(zhǎng)受到抑制，產(chǎn)SOD的能力相應(yīng)也受到抑制。

2.2.2 接種量 由圖3可知，每100 mL培養(yǎng)基接種量在3 mL時(shí)SOD活力最大，大于或小于3 mL時(shí)活力均有所下降。其原因可能是大于3 mL時(shí)菌體過(guò)多，菌體間會(huì)產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制，營(yíng)養(yǎng)不夠，因此產(chǎn)SOD的能力也相對(duì)減弱；而小于3 mL時(shí)菌體太少，不能達(dá)到生長(zhǎng)旺盛的狀態(tài)，SOD活力自然降低。

2.2.3 初糖濃度 假絲酵母一般在糖濃度相對(duì)較高的環(huán)境中生長(zhǎng)。由圖4可知，初糖濃度在70 g/L時(shí)假絲酵母產(chǎn)SOD能力最強(qiáng)，在50 g/L時(shí)次之，初糖濃度過(guò)高或過(guò)低時(shí)SOD活性都較小。

2.3.4 pH 由圖5可知，當(dāng)pH在5～7時(shí)，SOD活力變化很大，pH 5.8時(shí)假絲酵母產(chǎn)SOD能力最高，而在其他pH時(shí)產(chǎn)SOD能力均不高，說(shuō)明假絲酵母產(chǎn)SOD的能力對(duì)pH的要求較高。

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)極差分析（表6），可以看到四個(gè)因素對(duì)假絲酵母產(chǎn)SOD影響的順序?yàn)镃>A> D> B，即初糖濃度對(duì)假絲酵母產(chǎn)SOD影響最大，培養(yǎng)溫度次之， pH和接種量對(duì)其影響最小。其最佳組合條件為：在初糖濃度為50 g/L，pH為5.8的培養(yǎng)基中，每100 mL培養(yǎng)基接種3 mL，在26 ℃生長(zhǎng)3 d所得的菌體具有最高的產(chǎn)SOD能力。

3 小結(jié)與討論

通過(guò)上述試驗(yàn)可以得到如下結(jié)論：從菊?qǐng)@土壤中分離篩選的SOD酶源菌株，經(jīng)鑒定確定其為團(tuán)假絲酵母（Candida glaebosa）；單因素試驗(yàn)表明該假絲酵母產(chǎn)SOD最適pH為5.8，最適生長(zhǎng)溫度為28 ℃，最適初糖濃度為70 g/L，在培養(yǎng)的過(guò)程中，最佳接種量為3 mL/100 mL。 正交試驗(yàn)結(jié)果表明最佳的組合條件為：菌種在初糖濃度為50 g/L、pH為5.8的培養(yǎng)基中，每100 mL培養(yǎng)基接種3 mL，在26 ℃生長(zhǎng)3 d所得的菌體具有最大的產(chǎn)SOD能力。這些條件中，初糖濃度對(duì)假絲酵母產(chǎn)SOD影響最大，培養(yǎng)溫度次之， pH和接種量對(duì)其影響最小。

本研究從假絲酵母中提取SOD，一方面拓寬了現(xiàn)有提取SOD原料的選擇面，另一方面也是在酵母菌領(lǐng)域中提取SOD的一個(gè)菌種的新發(fā)現(xiàn)。試驗(yàn)證明該菌株有較強(qiáng)的產(chǎn)SOD能力，通過(guò)對(duì)其生長(zhǎng)條件的優(yōu)化，最佳組合條件下，假絲酵母的粗酶液活性可以達(dá)到702.96 U/g，這說(shuō)明該假絲酵母中有較高含量的SOD，這不僅可以解決原料缺陷的問(wèn)題，還可以大量地發(fā)酵生產(chǎn)，降低成本，具有較大的應(yīng)用前景。然而，試驗(yàn)菌株測(cè)得的SOD活力和以前的研究相比，活性并不高，這可能有四個(gè)方面的原因：一是破壁提取方法的選擇不能適應(yīng)試驗(yàn)的要求，沒(méi)有把假絲酵母中的SOD完全提取出來(lái)，此處選擇的是異丙醇破壁法，據(jù)有些資料顯示其是最好的破壁方法，但是也有一些資料顯示甲苯法破壁效果最好[10]；二是該假絲酵母從土壤中獲取，可能不是產(chǎn)SOD最好的菌株；三是本試驗(yàn)采用微量鄰苯三酚自氧化法測(cè)活，測(cè)定過(guò)程中，酶液、鄰苯三酚、Tris的溫度較難控制，一般酶最適反應(yīng)溫度在25 ℃，溫度不適將影響SOD作用的發(fā)揮，從而不能很好地控制鄰苯三酚自氧化；四是SOD在常溫下比較容易失活，可能造成了SOD的失活。

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（責(zé)任編輯 龔 艷）