一株產油酵母菌的紫外誘變選育

摘要：以產油酵母菌Y1為試驗菌株，通過確定出發菌株Y1的最佳紫外誘變時間，誘變后菌株的初篩和復篩，得到了一株突變菌株Y9。測得Y9的油脂產量為5.25 g/L，油脂含量為23.85%。與菌株Y1油脂產量2.11 g/L、含油量9.6%相比，Y9的產油量有明顯提高，因此擬選取油脂產量較高的Y9作為后續搖瓶發酵產脂研究的實驗菌株。

關鍵詞：產油酵母；紫外誘變；誘變選育；油脂產量

中圖分類號：Q93-331 文獻標志碼：A 文章編號：0439-8114（2013）22-5463-03

我國人均石化資源貯量十分有限，而能源需求量卻與日俱增。微生物油脂是石化能源替代品生物柴油的潛在油源[1]。由微生物生產富含多種生理功能的不飽和脂肪酸油脂已引起國內外的廣泛重視，因此微生物油脂的研究將成為21世紀油脂工業的一個重要方向[2]。微生物油脂，又稱單細胞油脂，是由酵母、霉菌和細菌等微生物在一定的條件下，利用碳水化合物、碳氫化合物和普通油脂作為碳源，在菌體內產生的油脂[3]。自然界中一些產油微生物在碳源充足而其他營養成分（通常為氮源）缺乏情況下，可以在胞內大量積累油脂，甚至達到自身干重60%以上[4]。產油酵母產脂發酵生產通常以單糖作為碳源，許多廉價原料如油料作物秸稈、煉油餅渣、廢糖液等通過化學或生物水解方式降解成單糖后可用于產油酵母產脂發酵[5，6]。

本研究以產油酵母菌Y1為實驗菌株，對不同紫外誘變時間進行研究，確定Y1的最佳紫外誘變時間，對誘變后菌株進行初篩和復篩后獲得油脂產量較高的突變菌株，以期為大規模發酵生產微生物油脂奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 產油酵母菌Y1，包頭師范學院生物科學與技術學院實驗中心保藏。

1.1.2 培養基和試劑 蘇丹黑B染色液，蘇丹黑B 0.5 g，加入75%乙醇100 mL，水浴加熱使其充分溶解，待其冷卻后過濾，得出的濾液即為蘇丹黑B染色液。液體種子培養基：葡萄糖 20 g/L，（NH4）2SO4 5 g/L，KH2PO4 1 g/L，酵母粉0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L。基礎發酵產脂培養基：葡萄糖30 g/L，蛋白胨1.5 g/L，KH2PO4 2 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，（NH4）2SO4 0.5 g/L，pH自然。

1.2 方法

1.2.1 初始菌株含油量測定

1）酵母菌Y1種子液的培養。取活化后斜面酵母菌Y1一環，接種于500 mL液體種子培養基中，28 ℃、180 r/min培養14 h，備用。

2）產脂發酵。以10%接種量接入液體種子，100 mL搖瓶裝液量25 mL，160 r/min、28 ℃恒溫振蕩培養48 h。

3）蘇丹黑B染色鏡檢。從培養平板挑取菌體涂片固定，用蘇丹黑B染色15 min，二甲苯沖洗，洗脫無色后再用番紅復染，水洗，吸干后顯微鏡觀察，菌體內脂肪顆粒呈藍黑色。

4）油脂提取。每克干菌體加入4 mol/L HCl 6 mL，振蕩混勻，室溫下放置30 min后，沸水浴3 min，-20℃速冷，加入10 mL氯仿∶甲醇（1∶1），充分振蕩后，4 500 r/min離心15 min，取氯仿層，加入等體積0.1%氯化鈉溶液，混勻，4 500 r/min離心15 min，用已知質量的蒸餾瓶收集氯仿層，用旋轉蒸發器揮發除去氯仿層，稱重，計算油脂產量（g/L）和菌體含油量（油脂得率），計算公式如下：

油脂產量=油脂質量/所用發酵液體積

油脂得率=油脂質量/干菌體質量×100%

1.2.2 紫外誘變處理菌懸液的制備 挑取已活化的斜面菌種1環接種到種子培養基中，28 ℃、180 r/min搖床培養48 h。吸取培養液于無菌離心管中，5 000 r/min離心5 min收集菌體，用生理鹽水洗滌2～3次，并稀釋為細胞濃度106個/mL，得菌懸液備用。

1.2.3 出發菌株最佳誘變時間的確定 取1 mL菌懸液于直徑60 cm培養皿中，開啟紫外燈（25 W），照射距離36 cm，開蓋進行紫外線照射，分別照射10、30、50、70、90 s后加蓋，無菌條件下取0.1 mL照射后菌懸液在固體培養基中涂平板，用黑布包裹培養皿后，在28 ℃培養箱培養2 d。紫外輻照處理后，選擇酵母菌致死率為75%～80%時的照射時間為最佳誘變時間[7]。

1.2.4 高產菌株的篩選 對目檢出的各種形態的菌落進行初篩和復篩以選出高產菌株。

初篩：從平板上長出的菌落中，挑取出直徑較大、光澤度好、顏色鮮紅、質地黏稠的單菌落，移至斜面，保藏。蘇丹黑染色后鏡檢出脂肪粒大且多的菌落，同時將該菌保存于斜面培養基。對培養皿和將要涂片的菌落進行一對一標號。

復篩：在初篩的基礎上，將脂肪粒大的菌落的斜面以3環的接種量接入100 mL產脂培養基，于30 ℃的恒溫搖床上培養4 d[8]，檢測其生物量、油脂產量，篩選出生物量和油脂產量均較高的菌株。

1.2.5 菌體生物量的測定 取50 mL發酵培養液置于100 mL離心管內，4 500 r/min離心10 min，收集菌體并在65 ℃下干燥至衡重，準確稱取干菌體質量，計算公式如下：

菌體生物量=干菌體質量/發酵液體積

1.2.6 菌體油脂的提取 每克干菌體加入4 mol/L HCl 6 mL，振蕩混勻，室溫下放置30 min后，沸水浴3 min，-20 ℃速冷，加入10 mL氯仿∶甲醇（1∶1），充分振蕩后，4 500 r/min離心15 min，取氯仿層，加入等體積0.1%氯化鈉溶液混勻，4 500 r/min離心15 min，用已知質量的蒸餾瓶收集氯仿層，用旋轉蒸發器揮發除去氯仿層，稱重計算油脂產量和菌體含油量。

1.2.7 遺傳穩定性實驗 將復篩的菌株接種至斜面培養基，連續傳代6次，搖瓶發酵后測其油脂產量，若油脂產量無顯著變化，說明其遺傳性狀穩定。

2 結果與分析

2.1 初始菌株含油量

經蘇丹黑B染色后，顯微鏡下可見初始菌株Y1菌體內含有一定數量的呈黑綠色脂肪顆粒，經測定此菌株含油量為9.6%，油脂產量為2.11 g/L，菌體油脂呈深綠色。有資料顯示，含油量在20%左右的產油菌株即具有潛在的生產開發價值[1]，因此后續實驗旨在提高該菌株的油脂產量和含油率，使其能夠成為具有生產開發價值的產油菌株。

2.2 紫外誘變的最佳誘變時間

通過不同時間梯度的紫外誘變后，其菌體致死情況見表1，選擇酵母菌致死率為75%～80%時的照射時間為最佳誘變時間[7]。由表1可知，該菌株的最佳紫外誘變時間為50 s。

2.3 紫外誘變初篩結果

蘇丹黑染色后鏡檢出脂肪粒大且多的菌落，以染色程度的深淺作為初篩的指標進行篩選。由表2可知，經初篩后通過染色程度挑選出Y2、Y8、Y9、Y12、Y17菌株進行復篩。

2.4 紫外誘變復篩結果

將初篩得到的Y2、Y8、Y9、Y12、Y17菌株分別以3環的接種量接入100 mL產脂培養基，其復篩結果見表3。由表3可知，Y9的油脂產量最高，為5.25 g/L。

2.5 紫外誘變遺傳穩定性試驗結果

將復篩后的突變株Y9接種固體斜面連續傳代6次，分別測其油脂產量，結果見表4。由表4可知，突變株油脂產量無顯著變化，證明其遺傳性狀穩定。

3 結論

通過對出發菌株酵母菌Y1的紫外誘變獲得一株突變菌株Y9，測得Y9的油脂產量為5.25 g/L，油脂含量為23.85%。與出發菌株Y1油脂產量2.11 g/L、含油量9.6%相比有較明顯提高，因此選取油脂產量較高的Y9作為后續搖瓶發酵產脂研究的試驗菌株。

參考文獻：

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[2] 趙宗保，華艷艷，劉 波.中國如何突破生物柴油產業的原料瓶頸[J].中國生物工程雜志，2005，25（11）：1-6.

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[7] MURPHY D J，VANCE J. Mechanisms of lipid body formation[J]. Trends Biochem Sci，1999，24（3）：109-115.

[8] 沈 萍，范秀容，李廣武.微生物學實驗[M].第三版.北京：高等教育出版社，1999.

（責任編輯 龔 艷）