莖瘤芥黑斑病菌rDNA ITS區(qū)序列分析

摘要：以莖瘤芥（Brassica juncea Coss. var. tumida Tsen et Lee）黑斑病病株為試材，對黑斑病菌5.8 S rDNA及其側(cè)翼ITS區(qū)序列進行克隆、測序和比對分析。結(jié)果表明，5個供試病菌堿基序列同蕓薹鏈格孢的堿基序列相似度達(dá)到99.68%，不存在大于3 bp的堿基差異；而與甘藍(lán)鏈格孢和蘿卜鏈格孢的堿基差異較明顯，均存在大于3 bp的堿基差異，且存在大量的缺失片段。初步確定引起莖瘤芥黑斑病的病原菌為蕓薹鏈格孢。

關(guān)鍵詞：莖瘤芥（Brassica juncea Coss. var. tumida Tsen et Lee）；黑斑病；ITS；蕓薹鏈格孢

中圖分類號：S436.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）20-5044-03

Sequence Analysis of ITS Region of rDNA of Brassica juncea Coss. var. tumida Tsen et Lee Black Spot Disease

LIU Hong-fang，CHEN Fa-bo，YANG Yong-qiang

（Life Science and Technology Institute， Yangtze Normal University， Chongqing 408100，China）

Abstract：Taking Brassica juncea Coss. var. tumida Tsen et Lee black spot disease as materials， 5.8 S rDNA and its flanking ITS were cloned， sequenced and aligned. The results showed that the sequence of 5 pathogen were almost identical with that of Alternaria brassicae. Similarity degree reached 99.68%. There was no differences more than 3 bp base. There were obvious differences between the sequence of A. brassicicola and A. japonica， more than 3 bp different base and a lot of deletions. It was prelimiarily dertermined that the pathogen caused the black spot disease on Brassica juncea Coss. var. tumida Tsen et Lee was Alternaria brassicae.

Key words： Brassica juncea Coss. var. tumida Tsen et Lee； black spot disease； ITS； Alternaria brassicae

莖瘤芥（Brassica juncea Coss. var. tumida Tsen et Lee）是我國特有的作物資源，榨菜是利用其瘤莖為原料，經(jīng)過專門的加工腌制而成的一種腌菜食品。在我國以“涪陵榨菜”最為著名，與歐洲酸菜、日本醬菜并稱世界三大名腌菜[1]。榨菜是重慶三峽庫區(qū)重要的農(nóng)業(yè)支柱產(chǎn)業(yè)之一，是當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要經(jīng)濟來源。黑斑病是莖瘤芥的主要病害之一，發(fā)生普遍，主要發(fā)生在莖瘤芥的莖和葉片上，此病發(fā)生后蔓延迅速，可導(dǎo)致莖瘤芥葉片枯死，植株早衰，甚至腐爛，嚴(yán)重影響莖瘤芥的產(chǎn)量和品質(zhì)。

研究表明，引起十字花科蔬菜黑斑病的病原菌包括蕓薹鏈格孢（Alternaria brassicae）、甘藍(lán)鏈格孢（A. brassicicola）和蘿卜鏈格孢（A. japonica）[2]。鏈格孢屬內(nèi)不同種之間培養(yǎng)性狀不穩(wěn)定，且高度相似和重疊，在實際操作中用傳統(tǒng)方法很難鑒定到種的水平[3]。Jasalavich等[4]對十字花科蔬菜上的鏈格孢屬真菌核糖體DNA序列進行分析比較，認(rèn)為可以基于其進行分類鑒定。目前，關(guān)于莖瘤芥黑斑病的研究鮮見報道。本試驗以我國莖瘤芥主產(chǎn)區(qū)涪陵5個不同種植區(qū)的莖瘤芥黑斑病病株為試材，通過對莖瘤芥黑斑病菌rDNA ITS序列進行分析，探索基于該區(qū)進行莖瘤芥黑斑病菌種水平上分類鑒定的可靠性，以期為該病的進一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試材料于2011年12月采自重慶市涪陵區(qū)李渡鎮(zhèn)、義和鎮(zhèn)、焦石鎮(zhèn)、馬武鎮(zhèn)、石勝鎮(zhèn)等5個莖瘤芥種植區(qū)。選取新發(fā)病的葉片作為分離材料，分離到的菌株經(jīng)單孢純化后保存于PDA培養(yǎng)基斜面上，分別編號為L1（李渡鎮(zhèn)）、L2（義和鎮(zhèn)）、L3（焦石鎮(zhèn)）、L4（馬武鎮(zhèn)）、L5（石勝鎮(zhèn)）等，置于4 ℃冰箱中貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA的提取

將供試菌株在 PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7～10 d，用無菌水洗下菌落表面的菌絲和分生孢子，轉(zhuǎn)接到SN液體培養(yǎng)基中，在25 ℃、150 r/min的條件下培養(yǎng)4～5 d后真空抽濾收集菌絲體，-20 ℃保存?zhèn)溆谩２捎肅TAB法提取基因組DNA[5]。

1.3 ITS序列的PCR擴增

利用上海英駿公司合成的引物（上引物5′TCC

GTAGGTGAACCTGCGG3′，下引物5′TCCTCCGCTT

ATTGATATGC3′）進行擴增。PCR擴增反應(yīng)體系（25 μL）：無菌水6.5 μL，2×Taq MasterMix 12.5 μL，上、下引物（10 ng/mL）各2 μL，DNA 2 μL（含100 ng DNA），液體石蠟 20 μL。2×Taq MasterMix由上海生工生物工程有限公司提供。反應(yīng)程序為：95 ℃ 預(yù)變性 5 min，1個循環(huán)；95 ℃變性 40 s，56 ℃ 退火40 s，72 ℃延伸 1 min，35 個循環(huán)；72℃ 延伸 10 min，1個循環(huán)；最后4 ℃保存。

1.4 PCR擴增產(chǎn)物的克隆及測序

利用SanPrep柱式DNA凝膠回收試劑盒（上海生工生物工程有限公司），對PCR擴增后的目的片段進行回收、純化。利用pMDl9-T載體（大連寶生物工程有限公司）對純化后的產(chǎn)物進行連接。連接體系（10 μL）：回收純化的DNA 4 μL，載體1 μL，Solution I 5 μL，在16 ℃下連接過夜。利用Competent Cell Preparation Kit 試劑盒（大連寶生物工程有限公司）制備DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將連接液加入感受態(tài)細(xì)胞中，42 ℃熱擊轉(zhuǎn)化，用無氨芐青霉素（Amp）液體LB培養(yǎng)基37 ℃、150 r/min培養(yǎng)1 h，使菌體復(fù)蘇。用涂布棒將菌液均勻地涂在含有Amp的LB固體培養(yǎng)基上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，過夜培養(yǎng)12～16 h。挑取陽性克隆的大腸桿菌加入到Amp 液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)至菌液渾濁（約2 h）。采用PCR法對陽性克隆進行鑒定，PCR反應(yīng)體系（15 μL）：7.5 μL 2×Taq MasterMix，上、下引物（10 ng/mL）各1 μL，菌液1 μL（含50 ng DNA），無菌水 4.5 μL。PCR反應(yīng)程序與1.3相同，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。每份材料挑取5～20個單菌落。將獲得的菌液送至上海生工生物工程有限公司進行測序。

1.5 序列分析

測序結(jié)果出來后，用CExpress軟件進行序列拼接，在美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）進行Blast序列比對，并搜索已發(fā)表的蕓薹鏈格孢、甘藍(lán)鏈格孢及蘿卜鏈格孢的核糖體5.8 S rDNA及其側(cè)翼的ITS區(qū)序列，利用DNAMAN 4.0軟件進行序列比對，確定感染莖瘤芥黑斑病病原菌的種類。

2 結(jié)果與分析

采用DNAMAN 4.0軟件比對5個莖瘤芥黑斑病核糖體5.8 S rDNA及其側(cè)翼的ITS區(qū)序列，發(fā)現(xiàn)5個DNA的序列基本相同，不存在大于3 bp的堿基差異，推測感染這5份材料的黑斑病病菌可能是同一種。再將5個莖瘤芥基因序列與已公布的蕓薹鏈格孢、甘藍(lán)鏈格孢和蘿卜鏈格孢對應(yīng)序列進行比對分析。

將莖瘤芥黑斑病rDNA ITS區(qū)序列與蕓薹鏈格孢相應(yīng)區(qū)域序列進行對比，蕓薹鏈格孢GeneBank登錄號為FJ869872，片段長度為575 bp，序列對比有差異的堿基如圖1所示。由圖1可知，5個序列與已公布的蕓薹鏈格孢相應(yīng)序列的相似度達(dá)到99.68%，且不存在大于3 bp的堿基差異。5個莖瘤芥rDNA ITS區(qū)域序列與蕓薹鏈格孢對應(yīng)序列存在的差異僅為2個堿基，這可能與測序誤差有關(guān)。

莖瘤芥黑斑病rDNA ITS區(qū)序列與甘藍(lán)鏈格孢相應(yīng)區(qū)域序列進行比對，甘藍(lán)鏈格孢GeneBank登錄號為JF417686，片段長度為514 bp，其序列比對中出現(xiàn)較大差異部分如圖2所示。由圖2可知，6組序列在65～67 bp和70～72 bp處分別存在3個堿基的插入/缺失，且在48～62 bp處堿基存在大量插入/缺失。

莖瘤芥黑斑病rDNA ITS區(qū)序列與蘿卜鏈格孢相應(yīng)區(qū)域序列進行對比，蘿卜鏈格孢GeneBank登錄號為JF742643，片段長度為553 bp，比對有差異的序列見圖3。由圖3可知，6組序列在61～64 bp處存在4個堿基差異，在175～177 bp處存在3個堿基差異，在536～541 bp處存在6個堿基差異，且在65～95 bp處存在大量的插入/缺失，542～544 bp處存在3個堿基的插入/缺失。

綜上分析，5個供試序列與已公布的蕓薹鏈格孢序列的相似度達(dá)到99.68%，且不存在大于3 bp的堿基差異；與甘藍(lán)鏈格孢和蘿卜鏈格孢序列的相似度分別為95.62%和92.86%，且存在3 bp及以上的堿基差異。因此，可以確定感染采集莖瘤芥植株的黑斑病病菌種類為蕓薹鏈格孢。

3 結(jié)論與討論

蕓薹鏈格孢Alternaria brassicae，甘藍(lán)鏈格孢A. brassicicola和蘿卜鏈格孢A. japonica均可引起十字花科蔬菜黑斑病。經(jīng)過對供試Alternaria屬真菌核糖體5.8 S rDNA及其側(cè)翼ITS區(qū)的測序結(jié)果表明，5個序列與已公布的蕓薹鏈格孢相似度達(dá)到99.68%，且不存在大于3 bp的堿基差異；與甘藍(lán)鏈格孢和蘿卜鏈格孢的相似度分別為95.62%和92.86%，且存在3 bp及以上的堿基差異。初步確定，引起莖瘤芥黑斑病的病原菌為蕓薹鏈格孢Alternaria brassicae。

本試驗證明rDNA-ITS序列分析法在莖瘤芥黑斑病菌的分類鑒定上的可行性，但從測序結(jié)果來看，試驗所用特異性引物還可以改良，根據(jù)測試的序列比對分析，將本次試驗的下引物改為如下序列將更適宜，改良后的下引物為：5′TCCTCCGCTTATT

GATATGC3′，特異性引物改良后使擴增條帶更明顯、更清晰；另外，供試材料為5份，有些偏少，且采集地點集中于涪陵地區(qū)，代表性不強，不能確定引起莖瘤芥黑斑病菌的只有蕓薹鏈格孢。因此，甘藍(lán)鏈格孢A. brassicicola和蘿卜鏈格孢A. japonica是否也可引起莖瘤芥黑斑病還需進一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] 肖崇剛，郭向華，韓海波，等.涪陵榨菜根腫病病菌鑒定及主要特性[J].西南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2002，24（6）：539-541.

[2] 李明遠(yuǎn).十字花科蔬菜黑斑病識別與防治[J].當(dāng)代蔬菜，2004（10）：34-35.

[3] 肖長坤，李 勇，李健強.十字花科蔬菜種傳黑斑病研究進展[J].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2003，8（5）：61-68.

[4] JASALAVICH G A， MORALES V M， PELCHER L E， et al. Comparison of nuclear ribosomal DNA sequence from Alternaria species pathogenic to crucifers[J]. Mycological Research，1995， 99（5）：604-614.

[5] GRAHAM G C， MAYERS P， HENRY R J. A simplified method for the preparation of fungal genomic DNA for PCR and RAPD analysis[J]. Biotechniques，1994，16（1）：48-50.