稻瘟菌激活蛋白基因的克隆及表達

摘要：以提取的稻瘟菌（Magnaporthe grisea）基因組DNA為模板，PCR擴增出激活蛋白目的基因DW，構建融合表達載體pGEX-KG-DW并進行IPTG誘導表達。SDS-PAGE電泳分析結果表明，pGEX-KG-DW載體添加IPTG后能在BL21中表達，在68 ku處存在一條特異性帶。

關鍵詞：稻瘟菌（Magnaporthe grisea）；激活蛋白；克隆；表達

中圖分類號：Q786 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）19-4807-02

激活蛋白是從交鏈孢菌（Alternaria spp.）、紋枯病菌（Rhizoctonia solani）、黃曲霉菌（Aspergillus spp.）、葡萄孢菌（Botrytis spp.）、青霉菌（Penicillium spp.）、木霉菌（Trichoderma spp.）、鐮刀菌（Fusarium spp.）等多種真菌中篩選、分離、純化出的一種新型蛋白[1]。其蛋白分子質量為42 ku，等電點為4.8[2]，能誘導多種植物產生系統抗性，促進植物生長，改善作物品質，可作為一種新型的廣譜、高效、多功能的生物農藥[3]。稻瘟病是由稻瘟菌（Magnaporthe grisea）引起的真菌病害[4]。從稻瘟菌中提取出的激活蛋白稱稻瘟菌激活蛋白[5]，該蛋白能明顯促進植物的發芽、生長、抗逆[6]。研究表明，經過激活蛋白處理后，水稻幼苗可增加對稻瘟菌的抗性[7]。植物激活蛋白也能干擾煙草花葉病毒外殼蛋白的體外聚合過程[8]。大田試驗證明激活蛋白處理后植物抗病率高達70%以上[9]。激活蛋白具有無公害、無殘留、無污染等特征，既可作為植物生長調節劑，又可作為生物農藥用于農業生產[10]。本研究通過構建稻瘟菌激活蛋白表達載體，并在大腸桿菌中實現該基因的高效表達，以期為產業化生產該蛋白提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

稻瘟菌北1-24，由中國農業科學院作物科學研究所提供；化學誘導型表達載體pGEX-KG，由中國農業科學院植物保護研究所分子生物學實驗室保存；pMD18-T載體，購于天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.4 融合表達載體的構建及在大腸桿菌中表達

1）以DW1和DW2為引物，pMD-18-DW為模板，PCR擴增稻瘟菌激活蛋白基因片段并連接至pGEX-KG載體上。將鑒定正確的pGEX-KG-DW質粒轉化大腸桿菌BL21。

2）將大腸桿菌BL21重組菌pGEX-KG-DW接種于5 mL LB液體培養基（含50 μg/mL氨芐青霉素），37 ℃、200 r/min振蕩培養12 h。然后以1∶100的比例轉接于5 mL LB液體培養基（含50 μg/mL氨芐青霉素），37 ℃、200 r/min振蕩培養至對數生長期（約2～3 h），加入0.5 mmol/L IPTG，37 ℃、200 r/min振蕩培養，進行誘導表達。分別在2、4、6、8、10 h進行取樣，SDS-PAGE電泳檢測。

2 結果與分析

2.1 稻瘟菌基因組DNA的提取及序列分析

提取了日本稻瘟菌基因組DNA，以基因組DNA為模板，PCR擴增激活蛋白基因，以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果見圖1。PCR擴增得到1條大小為1.6 kb的片段，并送至上海申能博采生物技術公司進行測序，同源性為100%。

2.2 融合表達載體的構建及在大腸桿菌中的表達

經序列測定，克隆載體pMD-18-DW插入片段中引入的BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ限制性內切酶位點、起始密碼子、終止密碼子和讀碼框正確。BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切pMD-18-DW，回收目的片段與pGEX-KG載體連接，構建融合表達載體pGEX-KG-DW，轉化大腸桿菌BL21。

結果（圖2）表明，0.5 mmol/L IPTG誘導目的蛋白在大腸桿菌BL21中表達。泳道1為連有目的蛋白的載體不加誘導物在BL21中的表達，結果顯示沒有特異性帶；泳道2為連有目的蛋白的載體添加IPTG后能在BL21中的表達，在68 ku處存在一條特異性帶。以上誘導時間均為5 h。

3 小結與討論

本研究利用PCR擴增出1.6 kb的基因片段，然而從稻瘟菌基因組全序列分析推斷出的激活蛋白基因大小只有1.0 kb，基因組DNA由于含有內含子，擴增得到1.6 kb的片段是正常現象。稻瘟菌激活蛋白基因在融合表達載體中可以正常表達，但表達量較低，最佳的誘導條件有待于進一步優化選擇。本試驗同時也研究了激活蛋白非融合表達載體pBV221的構建及表達，結果重組非融合蛋白無法表達，具體原因不是很清楚，推測可能是由于此蛋白對大腸桿菌有毒性，這方面內容也有待于進一步研究。

現代生物技術的發展，特別是基因工程的應用，給蛋白類農藥的研究注入了新的活力，現已成為生物農藥改良的有效途徑。利用分子生物學技術，從分子水平研究具有藥性功能的微生物基因及抗病蟲蛋白與宿主受體的相互作用及其機理，通過研究其編碼基因的克隆和表達，為蛋白類農藥生物合成和提高蛋白類農藥的效用提供分子生物學的理論依據。

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