釀酒酵母ARS305側(cè)翼序列對其自主復(fù)制活性的影響

摘要：利用PCR技術(shù)擴(kuò)增了釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Ⅲ號染色體上以ARS（Autonomously replicating sequence，ARS）305為核心的不同長度側(cè)翼序列，并將其構(gòu)建到酵母整合型載體pRS405中獲得了重組質(zhì)粒PA500、PA1000、PA2000，然后通過電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入釀酒酵母細(xì)胞中，測定了不同ARS305片段對酵母轉(zhuǎn)化效率及質(zhì)粒在酵母中穩(wěn)定性。結(jié)果表明，并非側(cè)翼序列越長ARS活性越高，重組質(zhì)粒PA1000具有比PA2000更高轉(zhuǎn)化頻率和轉(zhuǎn)化穩(wěn)定性，推測ARS兩側(cè)序列存在一些順式和反式的調(diào)控機(jī)制影響ARS自主復(fù)制功能。

關(guān)鍵詞：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）；ARS305；重組質(zhì)粒；復(fù)制起始活性

中圖分類號：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）19-4804-03

真核生物染色體中存在多個復(fù)制起始位點(diǎn)，能夠使真核生物巨大的基因組在較短時間內(nèi)完成復(fù)制。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的復(fù)制起始位點(diǎn)稱為自主復(fù)制序列（Autonomously replicating sequence，ARS），首次在釀酒酵母的TRPI基因緊密連鎖DNA序列中發(fā)現(xiàn)，含有ARS的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母后能獨(dú)立存在于宿主染色體外且能自主復(fù)制[1]。此后，Irene等[2]從釀酒酵母Ⅲ號染色體中共發(fā)現(xiàn)有19個ARS，約為150 bp，其中含有一段11 bp富含A/T的保守序列ACS[5′-（A/T）TTTA（T/C）（A/G）TTT（A/T）-3′]。然而含有保守序列ACS的不同片段在ARS活性方面卻表現(xiàn)出明顯的差異，部分活性高的ARS卻沒有ACS保守序列[3]。說明DNA復(fù)制起始功能不僅由ACS保守序列決定，還需核心序列3′和5′側(cè)翼序列的參與。

在酵母遺傳工程中，不考慮載體-宿主系統(tǒng)的類型、外源基因產(chǎn)物的性質(zhì)和工程菌的培養(yǎng)條件等因素，重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性可以從功能上鑒定復(fù)制起始位點(diǎn)的活性。通過DNA重組技術(shù)將可能含有ARS的DNA片段構(gòu)建到缺失復(fù)制起始位點(diǎn)的質(zhì)粒后轉(zhuǎn)入細(xì)胞，如果它有較高的細(xì)胞轉(zhuǎn)化率并且表現(xiàn)為遺傳不穩(wěn)定性，就表明該片段在宿主菌中可能有復(fù)制起始位點(diǎn)活性[4]。本研究擴(kuò)增了以ARS305為核心的不同長度側(cè)翼序列，并將其構(gòu)建到酵母整合型載體pRS405中，通過電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入釀酒酵母細(xì)胞中，測定了不同ARS片段對酵母轉(zhuǎn)化效率及質(zhì)粒在酵母中穩(wěn)定性，為后續(xù)以酵母作為模式生物研究真核基因的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄機(jī)制提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 Esherichia coli DH5α為內(nèi)蒙古科技大學(xué)生物工程與技術(shù)研究所基因工程實(shí)驗(yàn)室保藏。釀酒酵母YPH499（MATα ura3-52 lys2-801 anber ade2-101 ochre trp1-Δ63 his3-Δ200 leu2-Δ1）、整合型載體pRS405由美國新澤西州醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與分子遺傳學(xué)部Newlon教授饋贈。

1.1.2 試劑 DNA Marker，限制性內(nèi)切酶，T4 DNA連接酶，Taq DNA聚合酶及PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；Agarose購自Invitrogen公司；PCR引物合成及DNA測序工作由生工生物工程（上海）有限公司完成；其他試劑藥品為進(jìn)口分析純和生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基 大腸桿菌的培養(yǎng)使用LB培養(yǎng)基（胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，酵母浸提物5 g/L，固體培養(yǎng)基瓊脂含量15 g/L）；釀酒酵母YPH499的培養(yǎng)使用YPD培養(yǎng)基（胰蛋白胨20 g/L，酵母浸提物10 g/L，高壓滅菌20 min 后，加入100 mL滅菌的20 g/L葡萄糖溶液，固體培養(yǎng)基瓊脂含量15 g/L）。SD 篩選培養(yǎng)基（1.34%YNB，2%葡萄糖，2%瓊脂）；氨基酸（20 mg/L Trp，20 mg/L His，20 mg/L Lys）。

1.2 方法

1.2.1 酵母基因組的提取 珠磨法提取：收集過夜培養(yǎng)16～18 h的釀酒酵母YPH499菌液，用TE洗滌2次溶于200 μL TE中；加入50 mg玻璃珠（直徑0.3～0.5 mm）和100 μL酚∶氯仿（25∶24，V/V），漩渦振蕩2～3 min；12 000 r/min離心2 min，取上清，加入等體積酚∶氯仿（25∶24，V/V），抽提后12 000 r/min離心5 min；取上清，加入0.5 μL RNaseA，37 ℃溫浴30 min；加入2倍體積無水乙醇，-20 ℃靜置30 min；10 000 r/min離心5 min，沉淀物用70%乙醇洗2次，自然干燥后溶于20 μL TE，以0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 ARS305側(cè)翼序列的擴(kuò)增 根據(jù)GenBank中釀酒酵母Ⅲ號染色體上的ARS305序列，利用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)了3對特異性引物（表1），由生工生物工程（上海）有限公司合成。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積為 25 μL：模板DNA 2.0 μL、10×DNA Polymerse Buffer 2.5 μL、EX Taq DNA Polymerse（5 U/μL）0.5 μL、dNTPs （10 mmol/L） 2.0 μL、引物F1和R2（10 mmol/L） 1.0 μL、ddH2O 16.0 μL。PCR反應(yīng)后回收目的條帶，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 酵母自主復(fù)制質(zhì)粒的構(gòu)建 采用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ（PstⅠ）和BamHⅠ雙酶切PCR擴(kuò)增純化產(chǎn)物和整合型載體pRS405，分別回收目的片段和載體片段， 16 ℃條件下T4 DNA連接酶連接24 h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐抗性（50 μg/mL）的LB平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒雙酶切鑒定陽性克隆，同法構(gòu)建另外兩個重組質(zhì)粒。

1.2.4 重組質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化 將純化的質(zhì)粒加入到 100 μL釀酒酵母YPH499感受態(tài)細(xì)胞中，輕柔混勻后移入預(yù)冷的2 mm電擊杯中。按照文獻(xiàn)[5]設(shè)置參數(shù)，電擊后迅速加入1 mL預(yù)冷的1 mol/L山梨醇緩沖液。28 ℃靜置復(fù)蘇 1～2 h后加入1 mL液體YPD培養(yǎng)基，于30 ℃、100 r/min下培養(yǎng)1 h。濃縮培養(yǎng)液，將其均勻涂布于含100 μg/mL亮氨酸的YPD平板上，30 ℃避光下培養(yǎng)，得到轉(zhuǎn)化子。再從酵母轉(zhuǎn)化子中提取質(zhì)粒DNA，轉(zhuǎn)化入E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，抽提質(zhì)粒 DNA 并進(jìn)行雙酶切鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 ARS305側(cè)翼序列的擴(kuò)增

PCR產(chǎn)物經(jīng) 0.8%的瓊脂糖凝膠電泳后發(fā)現(xiàn)，所擴(kuò)增片段分別為1 200、1 700、2 300 bp，與預(yù)期大小相符（圖1）。

2.2 酵母自主復(fù)制質(zhì)粒的構(gòu)建及檢測

酵母整合型質(zhì)粒pRS405可以在大腸桿菌中復(fù)制，氨芐青霉素抗性基因可作為篩選標(biāo)記。但它不能在酵母中復(fù)制，只有通過重組到酵母染色體上才能隨染色體的復(fù)制而復(fù)制。pRS405帶有LEU基因可作為在酵母LEU基因缺失株中的篩選標(biāo)記。將擴(kuò)增的目的片段插入到酶切的pRS405載體中以檢測ARS305側(cè)翼序列自主復(fù)制活性。挑取單菌落，接種于氨芐抗性液體培養(yǎng)基，37 ℃過夜培養(yǎng)，堿裂解法提取質(zhì)粒。經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，電泳結(jié)果與預(yù)期大小相符（圖2），表明成功構(gòu)建了自我復(fù)制型載體PA500、PA1000、PA2000。

2.3 ARS功能質(zhì)粒丟失率的測定

酵母轉(zhuǎn)化效率是鑒定自主復(fù)制活性強(qiáng)弱的直接指標(biāo)。將質(zhì)粒PA500、PA1000、PA2000定量轉(zhuǎn)化酵母。結(jié)果表明，盡管這些片段均有ARS活性，但酵母轉(zhuǎn)化效率存在一定差異，且質(zhì)粒PA1000比PA2000有更高的轉(zhuǎn)化頻率。

由于含有 ARS 片段的質(zhì)粒在酵母細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立復(fù)制，并非整合到酵母染色體上，所以在細(xì)胞分裂過程中，就存在質(zhì)粒丟失問題。將含有質(zhì)粒PA500、PA1000、PA2000的酵母于完全YPD培養(yǎng)基中經(jīng)約8代培養(yǎng)（16 h），經(jīng)計(jì)算質(zhì)粒PA500每代的丟失率為16.2%，質(zhì)粒PA1000 每代的丟失率為10.7%，質(zhì)粒PA2000每代的丟失率為13.8%。這說明它們在酵母中都是不穩(wěn)定的（表2）。

3 小結(jié)與討論

盡管真核生物的復(fù)制在進(jìn)化中有很強(qiáng)的保守性，但不同物種的DNA復(fù)制起始位點(diǎn)之間卻缺少明顯的一致序列或結(jié)構(gòu)。釀酒酵母的復(fù)制起始位點(diǎn)由11 bp的ACS保守序列和幾個輔助序列（B區(qū)）組成。ACS是復(fù)制起始識別蛋白ORC結(jié)合位點(diǎn)。ACS的側(cè)翼序列不保守，但其對ARS的活性卻是非常重要的[7]。

雖然在酵母中大多數(shù)ARS都有ACS，但其中有些位點(diǎn)的使用頻率比其他位點(diǎn)的更高，且有一些潛在的復(fù)制起始位點(diǎn)在正常生長條件下從不使用，而一旦這些潛在的復(fù)制起始位點(diǎn)序列克隆到質(zhì)粒上，都能有效地作為復(fù)制起始位點(diǎn)行使其功能。因此，在酵母細(xì)胞核中染色體的環(huán)境諸如核小體定位、染色質(zhì)修飾、ARS序列特征等能決定哪些潛在的位點(diǎn)被用作起始點(diǎn)以及使用的頻率。Theis等[3]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)敲除Ⅲ號染色體上其他高活性ARS，ARS308復(fù)制起始活性大大增強(qiáng)。Eaton等[8]等利用高通量列分析測定了酵母體內(nèi)ARS兩側(cè)的核小體定位圖譜，發(fā)現(xiàn)酵母復(fù)制起始位點(diǎn)ARS兩側(cè)核小體分布具有一定的規(guī)律，復(fù)制起始識別蛋白ORC的結(jié)合也需要ARS兩側(cè)精確的核小體定位。

本研究擴(kuò)增了釀酒酵母Ⅲ號染色體有活性的ARS305及以ARS305為核心不同長度的側(cè)翼序列，并將目的片段構(gòu)建到酵母整合型載體pRS405中獲得重組質(zhì)粒PA500、PA1000、PA2000。酵母電轉(zhuǎn)化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ARS活性不僅受ACS元件控制，其旁側(cè)序列對其活性也有重要影響，且并非側(cè)翼序列越長活性越高（PA1000具有比PA2000更高轉(zhuǎn)化頻率和轉(zhuǎn)化穩(wěn)定性），推測延長的1 000 bp序列為ARS305活性負(fù)調(diào)節(jié)元件，與相應(yīng)的反式作用因子共同調(diào)控ARS305活性，因此ARS功能并不完全依賴于ACS和解鏈程度，可能涉及一些順式和反式的調(diào)控機(jī)制。

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