釀酒酵母ARS305側(cè)翼序列對(duì)其自主復(fù)制活性的影響

摘要：利用PCR技術(shù)擴(kuò)增了釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Ⅲ號(hào)染色體上以ARS（Autonomously replicating sequence，ARS）305為核心的不同長度側(cè)翼序列，并將其構(gòu)建到酵母整合型載體pRS405中獲得了重組質(zhì)粒PA500、PA1000、PA2000，然后通過電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入釀酒酵母細(xì)胞中，測(cè)定了不同ARS305片段對(duì)酵母轉(zhuǎn)化效率及質(zhì)粒在酵母中穩(wěn)定性。結(jié)果表明，并非側(cè)翼序列越長ARS活性越高，重組質(zhì)粒PA1000具有比PA2000更高轉(zhuǎn)化頻率和轉(zhuǎn)化穩(wěn)定性，推測(cè)ARS兩側(cè)序列存在一些順式和反式的調(diào)控機(jī)制影響ARS自主復(fù)制功能。

關(guān)鍵詞：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）；ARS305；重組質(zhì)粒；復(fù)制起始活性

中圖分類號(hào)：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）19-4804-03

真核生物染色體中存在多個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)，能夠使真核生物巨大的基因組在較短時(shí)間內(nèi)完成復(fù)制。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的復(fù)制起始位點(diǎn)稱為自主復(fù)制序列（Autonomously replicating sequence，ARS），首次在釀酒酵母的TRPI基因緊密連鎖DNA序列中發(fā)現(xiàn)，含有ARS的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母后能獨(dú)立存在于宿主染色體外且能自主復(fù)制[1]。此后，Irene等[2]從釀酒酵母Ⅲ號(hào)染色體中共發(fā)現(xiàn)有19個(gè)ARS，約為150 bp，其中含有一段11 bp富含A/T的保守序列ACS[5′-（A/T）TTTA（T/C）（A/G）TTT（A/T）-3′]。然而含有保守序列ACS的不同片段在ARS活性方面卻表現(xiàn)出明顯的差異，部分活性高的ARS卻沒有ACS保守序列[3]。說明DNA復(fù)制起始功能不僅由ACS保守序列決定，還需核心序列3′和5′側(cè)翼序列的參與。

在酵母遺傳工程中，不考慮載體-宿主系統(tǒng)的類型、外源基因產(chǎn)物的性質(zhì)和工程菌的培養(yǎng)條件等因素，重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性可以從功能上鑒定復(fù)制起始位點(diǎn)的活性。通過DNA重組技術(shù)將可能含有ARS的DNA片段構(gòu)建到缺失復(fù)制起始位點(diǎn)的質(zhì)粒后轉(zhuǎn)入細(xì)胞，如果它有較高的細(xì)胞轉(zhuǎn)化率并且表現(xiàn)為遺傳不穩(wěn)定性，就表明該片段在宿主菌中可能有復(fù)制起始位點(diǎn)活性[4]。……