HPLC法測定“柴芩”注射液中柴胡皂苷A和黃芩苷的含量

摘要：分別建立了測定“柴芩”注射液中柴胡皂苷A和黃芩苷含量的高效液相色譜方法。

關鍵詞：“柴芩”注射液；柴胡皂苷A；黃芩苷；HPLC

中圖分類號：R284.1；O657.7+2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）19-4776-03

“柴芩”注射液是四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院自主研制的純中藥注射劑，由小柴胡湯中的核心藥對柴胡和黃芩兩味中藥配伍而成。本制劑能“清透半表之邪和清瀉半里之熱”，具有和解表里、疏肝解郁、扶正祛邪之功效，臨床可用于急性熱性病的進行期，以及伴有發(fā)熱病的一般性胃病、胃腸障礙等癥[1-3]。為了建立該制劑的質(zhì)量標準，有效地評價其內(nèi)在質(zhì)量，本試驗根據(jù)“柴芩”注射液的提取工藝、臨床功效和有效成分[4，5]，采用高效液相色譜（HPLC）法定量檢測了柴胡皂苷A和黃芩苷的含量，為有效控制其質(zhì)量提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

黃芩苷對照品（中國生物制品檢定所，批號：110715-20815）；柴胡皂苷A對照品（中國生物制品檢定所，批號：110777-200406）；甲醇、磷酸（色譜純）均購于科密歐化學試劑廠；“柴芩”注射液（20091228-20091230）由四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院藥學實驗室制備。

1.3 對照品溶液的配制

1.4 液相色譜條件

1.5 樣品處理

1.5.1 柴胡皂苷A供試品的制備 分別量取3批“柴芩”注射液（091228-091230）以0.45 μm微孔濾膜過濾，即得柴胡皂苷A供試品；并按處方制備不含柴胡的陰性對照品，按照柴胡皂苷A供試品溶液的制備方法制成不含柴胡皂苷A的陰性樣品。

1.5.2 黃芩苷供試品的制備 分別量取3批“柴芩”注射液（091228-091230）各1 mL于5個100 mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，混合均勻，0.45 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液作為黃芩苷供試品溶液；并按處方制備不含黃芩的陰性對照品，按照黃芩苷供試品溶液的制備方法制成不含黃芩苷的陰性樣品。

1.6 標準曲線的繪制

1.6.1 柴胡皂苷A標準曲線的繪制 分別吸取柴胡皂苷A對照品溶液2、4、6、8、10、12 μL進樣，HPLC檢測。每個濃度設3次重復，以柴胡皂苷A對照品含量（x）為橫坐標，以峰面積（y）為縱坐標，繪制標準曲線。

1.6.2 黃芩苷標準曲線的繪制 分別取吸取黃芩苷對照品溶液1、2、4、6、8、10 μL進樣，HPLC檢測。每個濃度設3次重復，以黃芩苷對照品含量（x）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標，繪制標準曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的選擇性

分別吸取柴胡皂苷A對照品、“柴芩”注射液和不含柴胡皂苷A陰性樣品溶液各10 μL進行分析。在柴胡皂苷A檢測色譜條件下，柴胡皂苷A的保留時間為8.342 min，供試品保留時間與對照品保留時間一致，陰性樣品中沒有發(fā)現(xiàn)干擾測定“柴芩”注射液中柴胡皂苷A的成分，結(jié)果見圖1、圖2和圖3。再分別吸取黃芩苷對照品溶液、“柴芩”注射液和不含黃芩苷陰性樣品溶液各10 μL進行測定，在黃芩苷檢測色譜條件下，黃芩苷的保留時間為9.725 min，供試品保留時間與對照品保留時間一致，陰性樣品在對照品色譜峰相應位置上無吸收峰，表明對測定無干擾，結(jié)果見圖4、圖5和圖6。

2.2 標準曲線

2.3 精密度試驗

2.4 穩(wěn)定性試驗

吸取柴胡皂苷A和黃芩苷供試品溶液各10 μL，分別在0、2、4、6、8 h進樣，測得柴胡皂苷A峰面積RSD為1.81%、黃芩苷峰面積RSD為1.82%。結(jié)果表明供試樣品在制備后8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 重復性試驗

2.6 加樣回收率試驗

2.6.1 柴胡皂苷A的加樣回收率 吸取1 mL柴胡皂苷A對照品溶液（0.48 mg/mL），60℃下烘干，殘渣分別加入10 mL已知含量的樣品溶液（091228）中，0.45 μm微孔濾膜過濾后進樣10 μL。HPLC檢測，連續(xù)6次，測定柴胡皂苷A的峰面積。結(jié)果顯示柴胡皂苷A的平均回收率為102.60%，RSD為0.95%。

2.6.2 黃芩苷的加樣回收率 吸取2.5 mL黃芩苷對照品溶液（0.46 mg/mL），60 ℃烘干，殘渣分別加入5 mL已知含量樣品溶液（091228）中，超聲溶解后再吸取1 mL加入100 mL容量瓶中，加50%甲醇至刻度，0.45 μm微孔濾膜過濾后進樣10 μL。HPLC檢測，連續(xù)6次，測定黃芩苷的峰面積。結(jié)果顯示黃芩苷平均回收率為100.55%，RSD為1.69%。

2.7 樣品含量測定

取3批注射液（091228-091230）按“1.5”項下方法制備供試品，每批平行制備3次。吸取對照品和供試品溶液各10 μL，按上述兩個色譜條件分別進行測定，并計算各樣品中的柴胡皂苷A、黃芩苷的含量。結(jié)果見表1。

3 小結(jié)與討論

中藥注射劑是在中藥制劑的基礎上結(jié)合現(xiàn)代制劑技術(shù)發(fā)展起來的新制劑，在醫(yī)療實踐中發(fā)揮著重要的作用，被認為是中國未來開拓國際醫(yī)藥市場的優(yōu)勢項目[8]。由于中藥注射液成分的復雜性，使得對其質(zhì)量控制難度較大。為了保證臨床用藥的安全性和有效性，中藥注射劑在確定成分含量的藥味時，要以中醫(yī)藥理論為指導，根據(jù)藥方功能，選擇多指標、多成分制定測定項目，采用科學的方法建立有效成分的含量測定方法，并制定出合理的限度指標[9]。但就《衛(wèi)生部藥品標準》中藥成方制劑中收載的注射液含量測定方法存在不完善、可控指標少甚至根本沒有含量的測定的問題[10]。

高效液相色譜法已廣泛地應用于中藥注射劑的質(zhì)量評價當中，通過指紋圖譜的含量或比例，能有效控制樣品的質(zhì)量，確保中藥注射劑工藝的科學性和質(zhì)量相對穩(wěn)定[11]?！安褴恕弊⑸鋭┯刹窈忘S芩兩味中藥組成，因此選擇其藥效成分柴胡皂苷A和黃芩苷共同作為其質(zhì)量控制指標，進行HPLC定量檢測。由于兩種成分吸收波長不同，且在注射劑中含量差異大，柴胡皂苷A則直接以原液進樣，而黃芩苷需在稀釋100倍后進樣，故將二者分別檢測。本試驗結(jié)果表明采用HPLC法測定“柴芩”注射液中柴胡皂苷A和黃芩苷的含量，方法可行、靈敏度高、重現(xiàn)性好、結(jié)果可靠，可有效用于該制劑的質(zhì)量控制。

參考文獻：

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