家蠅腸道益生菌胞外多糖抗氧化活性研究

摘要：從家蠅（Musca domestica）體內篩選出兩株高產胞外多糖的芽孢桿菌，分別命名為芽孢桿菌xzf1（Bacillus sp.）、芽孢桿菌xzf2（Bacillus sp.）。經多糖分離純化，芽孢桿菌xzf1產胞外多糖（Extracellular polysaccharides，EPS）BEPS11、BEPS12，芽孢桿菌xzf2產胞外多糖BEPS21、BEPS22、BEPS23。分別檢測其清除1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）自由基、羥自由基、超氧自由基的能力。結果表明，胞外多糖具有很強的清除活性氧自由基的能力，在較低濃度下很多多糖的清除能力都高于維生素C，是一種良好的天然抗氧化劑。該研究可為益生菌胞外多糖應用于實際生產提供一定的理論和方法依據。

關鍵詞：腸道益生菌；胞外多糖；活性氧自由基；抗氧化活性；家蠅（Musca domestica）

中圖分類號：Q936 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）19-4740-04

多糖在自然界高等植物、藻類、細菌及動物體內均存在，分布極廣。近年來，微生物來源的多糖越來越引起人們的廣泛注意[1]。多糖是由多個單糖或單糖衍生物聚合而形成的大分子生物有機物質[2]，是具有生物活性的復雜極性大分子，分子質量比較大，與核酸、蛋白質、脂類并稱為構成生命活動的四大基本物質，與維持生命所需的多種生理功能密切相關[3]。微生物胞外多糖是細菌、藍藻和真菌等微生物在生長代謝過程中產生的對其自身有保護作用的生物高聚物[4-6]，細菌胞外多糖在食品領域、醫藥領域、石油工業等領域已具有廣泛的應用，尤其是細菌胞外多糖因具有抗感染、抗病毒、抗輻射、抗血栓和免疫調節及抑制腫瘤細胞活性等作用而引起重視[7，8]。

家蠅（Musca domestica）屬昆蟲綱雙翅目環裂亞目蠅科，是中國大部分地區最常見、數量最多的一種蠅類。由于其生活環境復雜、食物來源惡劣，家蠅的生存能力除與自身體內存在大量抗菌活性物質有關外，與腸道內益生菌也有很大的關系。本研究旨在從家蠅腸道中篩選出產活性物質的益生菌，為活性多糖的篩選另辟一條思路，以獲得更多有用的活性物質。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

試劑：1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）購于Sigma公司，DEAE-Cellulose 52離子交換柱和Sephadex G-1000等試劑均為國產分析純級。

儀器：UV2550型紫外可見分光光度計（日本島津公司），SY-305B發酵罐（上海世遠生物設備工程有限公司），旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠），YXQ-LS-50G立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實驗有限公司醫療設備廠），MA99-2A自動核酸蛋白分離層析儀（上海滬西分析儀器有限公司），Scientz-10N型冷凍干燥機（寧波新芝生物科技有限公司）。

1.2 培養基

LB固體培養基[9]。

1.3 家蠅腸道產多糖菌的篩選

2011年10月在實驗室內捕獲活力很強的家蠅1只，立即將其浸入75%乙醇中進行體表消毒滅菌1 min，在無菌環境下利用滅菌研缽和石英砂磨碎，加入1 mL無菌生理鹽水溶解，隨后將其稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5系列梯度，均勻涂布于LB固體培養基表面，每梯度重復10次，在37 ℃倒置培養24 h后，選取黏稠、不易挑取的單克隆菌落劃線接種于試管斜面上，4 ℃保存備用。

1.4 菌種鑒定

從菌落形態和菌體顯微形態結構觀察鑒定菌屬[10]。

1.5 菌種培養

1.6 多糖提取

發酵液經12 000 r/min離心，合并上清液，于50 ℃用旋轉蒸發儀濃縮至200 mL， 加入4倍于濃縮液的無水乙醇進行充分攪拌，放入冰箱中低溫靜置24 h，將沉降物采用差速離心法逐級沉淀獲得兩種粗多糖沉淀，將分離后的多糖在真空冷凍機中干燥至粉末狀。

1.7 多糖純化

將上述得到的粗多糖使用DEAE-Cellulose 52離子交換柱分離純化，利用苯酚硫酸法檢測多糖含量，并將其中含量較高的成分收集起來，利用Sephadex G-1000進行分離純化，苯酚硫酸法和核酸蛋白儀跟蹤檢測獲得組分，冷凍干燥備用[12]。

1.8 多糖抗氧化活性的研究

1.8.2 超氧自由基的清除[14-19] 應用鄰苯三酚自氧化體外模擬化學反應，將1 mL 3 mmol/L的鄰苯三酚加入到含不同濃度多糖溶液的pH 8.2 Tris-HCl緩沖液中，在兩液混合后10 min內每隔30 s測其在325 nm處的吸光值。以不加多糖的反應液為對照計算多糖對O2-的清除率。維生素C也以同樣方法測定其清除率。清除率的計算公式如下：

清除率=[（k0-k1）/k0]×100%，式中，k0為鄰苯三酚自氧化速率，即自氧化曲線的斜率；k1為加入不同濃度多糖后氧化曲線的斜率。

1.8.3 羥自由基的清除[16-19] 采用H2O2/Fe2+體系，通過Fenton反應生成羥自由基，在體系內加入水楊酸捕捉羥自由基并產生有色物質，該物質在波長510 nm處有最大吸光值。取不同濃度的多糖溶液和維生素C各1 mL于試管中，分別加入9 mmol/L的FeSO4 1 mL、9 mmol/L的水楊酸乙醇溶液1 mL，最后加入9.8 mmol/L的H2O2 1 mL啟動整個反應。反應體系在37 ℃的水浴鍋中反應50 min，然后在510 nm處測定其吸光值Ai，用水代替H2O2用上述同樣方法測定吸光值Aj，用水代替多糖溶液（空白對照）用上述同樣方法測定吸光值Ac。維生素C也以相同方法測定其清除率。清除率的計算公式如下：清除率=[1-（Ai-Aj）/Ac]×100%。

2 結果與分析

2.1 菌種及形態學特征

通過菌落形態及顯微觀察，初步判定所篩選出的兩株細菌屬芽孢桿菌屬（Bacillus），分別命名為芽孢桿菌xzf1（Bacillus sp.）、芽孢桿菌xzf2 （Bacillus sp.），其菌落形態及顯微染色形態見圖1、圖2、圖3、圖4。兩株菌落皆不透明，乳白色，菌落突起皺褶，邊緣不整齊；不易挑起，黏稠拉絲狀，有霉菌抑菌圈。顯微觀察發現菌體呈桿狀，芽孢近圓形，有些芽孢正萌發。經《伯杰細菌鑒定手冊》初步鑒定為芽孢桿菌屬（Bacillus），而且應為產胞外多糖芽孢桿菌，經莢膜染色證實了這一點。

2.2 多糖的分離純化結果

兩株細菌擴大發酵培養后，培養液經濃縮后加4倍體積無水乙醇，首先采用差速離心法初步分離多糖，經冷凍干燥得粗多糖。芽孢桿菌xzf1發酵液提取獲得2種粗多糖，即BEPS11、BEPS12，其中BEPS11先被離心下來，為白色離散粗顆粒狀；BEPS12后被離心下來，為紅色黏稠狀。芽孢桿菌xzf2得3種粗多糖，即BEPS21、BEPS22、BEPS23，其中BEPS21先被離心下來，為白色顆粒狀；隨后得到BEPS22，為黃色顆粒狀；最后得到BEPS23，為淺棕色黏稠狀。經去蛋白脫色，再經柱層析純化，280 nm處沒有出現吸收峰，收集到的每管均檢測其含糖量，每種粗多糖只出現一個峰，表明獲得的5種多糖均為純品。

2.3 對DPPH自由基的清除作用

由圖5、圖6可知，5種多糖對DPPH自由基均有一定的清除作用，芽孢桿菌xzf1所產的BEPS11和 BEPS12在濃度為15 μg/mL時其清除率分別達到37.46%和34.58%，都高于維生素C一半的清除率。芽孢桿菌xzf2所產BEPS23在濃度為45 μg/mL時清除率為65.89%，高于維生素C，BEPS22、BEPS21在濃度為15 μg/mL時其清除率分別為34.58%和47.16%。由此可見，5種多糖對DPPH自由基均具有顯著的清除作用。

2.4 對超氧自由基的清除作用

由圖7、圖8可以看出，5種多糖對超氧自由基均有一定的清除作用。芽孢桿菌xzf1所產的BEPS11的清除率在30 μg/mL以下均高于維生素C，最高達到23.59%；BEPS12在濃度為30 μg/mL時其清除率達到14.68%。芽孢桿菌xzf2所產的3種多糖在15 μg/mL時其清除率均高于維生素C。BEPS21在濃度為45 μg/mL時其清除率為38.05%，高于維生素C；BEPS22在濃度為90 μg/mL時其清除率為49.95%；BEPS23在濃度為15 μg/mL時其清除率為33.63%。由此可見，5種多糖均能明顯降低鄰苯三酚發生自氧化的速率，即對超氧自由基有顯著的清除能力。

2.5 對羥自由基的清除作用

由圖9、圖10可見，5種多糖對羥自由基均有一定的清除作用。芽孢桿菌xzf1所產的BEPS11在濃度為75 μg/mL以下時其清除率均高于維生素C，在45 μg/mL時最高，達42.80%；BEPS12在濃度為75 μg/mL時其清除率最高，達31.70%。芽孢桿菌xzf2所產3種多糖在濃度為60 μg/mL以下時其清除率均高于維生素C，3種多糖清除率均隨多糖濃度升高而增大，在90 μg/mL時達到最高，分別為31.81%、34.08%、34.76%。

3 小結與討論

本試驗從家蠅體內篩選獲得兩株芽孢桿菌，從菌落形態觀察得知兩株細菌產多糖較高。多糖在各領域應用價值很高，因而本試驗對兩株細菌所產的5種多糖的分離純化和抗氧化性進行了研究。研究結果表明，經簡單差速離心獲得粗多糖，再通過層析純化和多糖含量檢測，所得多糖皆為純品，表明分步離心方法是一種分離多糖的簡單有效方法。

對5種多糖抗氧化性的研究結果表明，多糖具有顯著清除DPPH自由基、羥自由基和超氧自由基的能力。在較低濃度下，很多多糖的清除率高于維生素C，其中，BEPS23在濃度為45 μg/mL時對DPPH自由基的清除率為65.89%；BEPS22在濃度為90 μg/mL時對超氧自由基的清除率為49.95%；BEPS11在濃度為45 μg/mL時對羥自由基的清除率為42.80%。可見5種多糖均具有很強的抗氧化性，有一定的開發和應用潛力。本試驗結果為抗氧化性多糖的進一步研究和開發利用奠定了一定的理論基礎。

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