龍鳳濕地水體對霍夫水絲蚓DNA損傷的研究

摘要：利用龍鳳濕地不同濃度梯度（100%﹑95%﹑90%﹑85%﹑80%）的水樣培養霍夫水絲蚓（Limnodrilus hoffmeisteri），通過單細胞凝膠電泳試驗檢測霍夫水絲蚓細胞內DNA的損傷情況，研究龍鳳濕地水體對霍夫水絲蚓的遺傳毒性效應。結果表明，隨著水樣濃度的增加，霍夫水絲蚓DNA損傷也加大，龍鳳濕地水體具有遺傳毒性，需要重視對龍鳳濕地水質的監測和治理工作。

關鍵詞：龍鳳濕地；霍夫水絲蚓（Limnodrilus hoffmeisteri）；單細胞凝膠電泳；DNA損傷

中圖分類號：X832 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）14-3436-03

大慶市龍鳳濕地自然保護區位于大慶市龍鳳區東南，東經125°07′-125°15′，北緯46°28′-46°32′，距市中心僅8 km，由烏裕爾河下游流域永久性及季節性淡水沼澤地和小型潛水湖組成。自然保護面積約為5 996 hm2，核心面積為3 085.07 hm2，緩沖區面積為609.56 hm2。龍鳳濕地是鳥類重要的繁殖地和遷徙的中繼站，有野生動物207種，其中鳥類有76 種，有丹頂鶴、東方白鸛、大鴇等5種國家一級保護鳥類；有大天鵝、灰鶴、鴛鴦等19種國家二級保護鳥類；有大白鷺、青頭潛鴨等19種省級重點保護鳥類。另外，龍鳳濕地還有魚類45種，維管束植物314種[1]。龍鳳濕地是大慶油田和石油化工的滯洪區，在發揮防洪、滯洪功能的同時，還起著調節城市的小氣候、增加空氣溫度、滯留與降解自然來水中的有害物質、美化環境、豐富市民生活的作用。

1984年，Ostling首創了單細胞凝膠電泳技術（Single cell gel electrophoresis，SCGE），隨后Singh將方法加以完善，形成一種快速檢測單細胞DNA損傷的方法[2]。單細胞凝膠電泳通過對培養動物的細胞懸液進行電泳，從而檢測其DNA損傷，具有靈敏度高、迅速、簡便、經濟以及所需細胞少等優點。近年來，單細胞凝膠電泳技術廣泛應用于環境毒理學檢測、細胞凋亡研究、疾病的預防與檢測等領域[3]。霍夫水絲蚓（Limnodrilus hoffmeisteri）屬環節動物門寡毛綱近孔目顫蚓科水絲蚓屬，生活于污染較重的水域，如含有機質、腐殖質較多的污水溝、排水口等處。霍夫水絲蚓對環境條件的變化特別敏感，常被作為環境監測的指示動物[4]。本研究利用龍鳳濕地不同濃度梯度（100%﹑95%﹑90%﹑85%﹑80%）的水樣培養霍夫水絲蚓，通過單細胞凝膠電泳試驗檢測霍夫水絲蚓細胞內DNA的損傷情況，研究龍鳳濕地水體對霍夫水絲蚓的遺傳毒性效應，進而對龍鳳濕地水體毒性進行監測，為龍鳳濕地水污染防治和環境保護提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 霍夫水絲蚓購自大慶市讓胡路農貿花鳥魚市場。

1.1.2 儀器 Nikon 80i型熒光顯微鏡、DYY-6C+DYCE-27型電泳儀、DF-101S型集熱加熱式磁力攪拌器、TGL-16M型高速臺式冷凍離心機、Eppendorf微量移液器等。

1.2 方法

1.2.1 水樣的處理 按照《中華人民共和國國家環境保護標準》中關于天然水樣采集規定操作[5]。選擇3個樣點，分別標示為A、B、C樣點。用采樣桶每月采樣一次。采回的水樣于4 ℃保存備用。

1.2.2 霍夫水絲蚓的培養 在15～18 ℃條件下將霍夫水絲蚓培養于大培養皿中，每天清洗一次，2～3 d后選取長度相對一致的霍夫水絲蚓為試驗動物。分別設試驗組和對照組，EMS培養液作為陽性對照，蒸餾水作為陰性對照。

1.2.3 急性毒性試驗 將水樣用8層紗布過濾，用蒸餾水將過濾后的水樣配制成質量分數分別為80%、85%、90%、95%、100%的水樣培養液，各取50 mL倒入培養皿中。每組各隨機加入長度相近的霍夫水絲蚓30條，培養3 h，溫度控制在20～22 ℃。霍夫水絲蚓中毒后死亡的癥狀主要表現為身體泛白、失去伸縮能力、用解剖針碰觸完全無反應則為死亡[6]。

1.2.4 單細胞凝膠電泳試驗

1）單細胞懸液的制備。將染毒恢復后的霍夫水絲蚓取出，吸干水分，放入裝有緩沖液的研缽中充分研磨。將研磨液用200目尼龍網過濾、離心，吸取上清液。反復沖洗離心，取上清液。濾液即為霍夫水絲蚓單細胞懸液。

2）DNA損傷測試。按照《現代環境生物學實驗技術與方法》中單細胞凝膠電泳技術操作[7]。

1.2.5 數據分析 選擇有代表性的20個拖尾細胞，切換到圖像分析軟件窗口進行彗星測量、分析[8]。使用SPSS 10.0軟件和CASP軟件進行統計學分析。

2 結果與分析

2.1 A樣點水樣對霍夫水絲蚓DNA的損傷

從圖1可以看出，當龍鳳濕地A樣點水樣稀釋為80%～85%濃度時，DNA損傷程度比較小，而當濃度達85%以上時曲線斜度急速增大，表明霍夫水絲蚓DNA損傷加大。

2.2 B樣點水樣對霍夫水絲蚓DNA的損傷

由圖2可知，當龍鳳濕地B樣點水樣稀釋為80%～85%濃度時，DNA損傷程度比較小，而當濃度達90%以上時，曲線斜度急速增大，說明DNA損傷加大，其原因可能是污水濃度太大，嚴重影響霍夫水絲蚓DNA的復制，使DNA變異，產生嚴重的損傷。

2.3 C樣點水樣對霍夫水絲蚓DNA的損傷

從圖3可以看出，當龍鳳濕地C樣點水樣濃度在80%以上時，DNA損傷急劇上升，且DNA損傷程度較A樣點嚴重，這是由于C樣點更靠近東城區污水處理廠的排水渠，而A樣點則是在龍鳳濕地的中心地帶，兩個采樣點的水體受污染程序有較大差別。

3 小結與討論

龍鳳濕地水體對霍夫水絲蚓DNA有損傷，但在短時間內不足以致使霍夫水絲蚓死亡，說明城市污水經處理后流入龍鳳濕地對霍夫水絲蚓短時間內的影響不大，其原因可能是龍鳳濕地水體面積太大，使有毒物質稀釋；還有可能是排放入龍鳳濕地水體有毒物質含量較少，污水處理企業處理污水達到正常標準。隨著水樣濃度的增加，水中能造成DNA損傷的物質濃度也增大，致使霍夫水絲蚓DNA受到的損傷越重。

參考文獻：

[1] 徐長君，張國發.大慶濕地的生物多樣性及其保護策略[J].中國農學通報，2009，25（11）：215-219.

[2] 何 懼，劉玉清.單細胞凝膠電泳技術的研究進展與應用[J].國外醫學（衛生學分冊），1997，24（2）：85-89.

[3] 陸貽通，朱 江，余佳麗.環境污染物的分子毒理機制研究進展[J].環境污染與防治，2004，26（3）：185-188.

[4] 蔡曉明.羽搖蚊幼蟲和霍甫水絲蚓的生態毒理學研究[J].應用生態學報，1991，2（1）：52-57.

[5] 環境保護部.中華人民共和國國家環境保護標準（HJ 495-2009）：水質 采樣方案設計技術規定[M].北京：中國環境科學出版社，2009.

[6] 殷 華，闞曉微，史小航，等.亞甲基藍對水絲蚓的急性毒性[J].哈爾濱師范大學學報（自然科學版），2007，23（4）：80-82.

[7] 孔志明，楊柳燕，尹大強，等.現代環境生物學實驗技術與方法[M].北京：中國環境科學出版社，2005.51-58.

[8] 韓宗超，張蘇明.單細胞凝膠電泳在DNA損傷與修復檢測中的應用[J].中華檢驗醫學雜志，2000，23（3）：180-182.