甘藍型油菜MYB4基因反義植物表達載體的構建

摘要：將甘藍型油菜（Brassica napus L.）MYB4基因家族共保守的467 bp反義片段構建到中間載體pCambia2301G中，替換GUS基因，由CaMV35S啟動子驅動，形成了反義植物表達載體，命名為pCambia2301G-MYB4A， 并轉化到根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404中形成工程菌株，為進一步研究甘藍型油菜MYB4基因家族的功能奠定基礎。

關鍵詞：甘藍型油菜（Brassica napus L.）；苯丙烷代謝途徑；MYB4基因

中圖分類號：S565.4；Q943.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）14-3428-03

甘藍型油菜（Brassica napus L.）是重要的油料作物之一。甘藍型油菜中與苯丙烷代謝途徑相關的農藝性狀是研究人員長期致力于遺傳改良的焦點。經常發生的倒伏問題要求更加強壯的莖和分枝，抗病性的提高要求更高水平的受病原菌入侵而誘導的細胞壁木質化[1-3]。另外，油菜種皮柵狀細胞層中的色素主要與種皮中類黃酮類物質緊密相關，種皮中類黃酮類物質積累越多，種皮的顏色就越深，積累越少或沒有時種皮就呈黃色，即呈現種胚的顏色，從而表現出黃子性狀的優質特性[4，5]。

AtMYB4屬于擬南芥R2R3-MYB家族的一種新的負調控轉錄因子，對于植株中抗紫外線類的芥子酸酯類物質的合成具有重要調控作用，該基因在大多數的植物組織中均有表達。研究發現擬南芥AtMYB4基因突變體葉片中芥子酸酯的含量升高，并呈現出比野生型更強的紫外線耐受能力。已報道AtMYB4轉錄因子調控苯丙烷代謝途徑關鍵酶基因C4H的表達[6-8]。因此，研究MYB4基因有利于闡明甘藍型油菜苯丙烷類物質合成和相關性狀形成的分子機理。本研究通過構建甘藍型油菜MYB4基因反義植物表達載體，為研究MYB4基因家族功能，闡明油菜木質素、種皮色素、花青素、植保素、芥子酸等成分的生物合成機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種及質粒 E. coli DH5α、根癌農桿菌（A. tumefaciens）LBA4404、植物表達中間載體pCambia2301G均由重慶市油菜工程技術研究中心保存；pMD18-T載體購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.2 試劑 Taq DNA聚合酶、胰蛋白胨、酵母浸出物、氨芐青霉素（Amp）、卡那霉素（Kan）、利福平（Rif）、鏈霉素（Str）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；dNTPs、瓊脂糖、λ DNA/HindⅢ DNA Marker、DL2000 DNA Marker及DNA Ligation Kit均購自寶生物工程（大連）有限公司；限制性內切酶購自美國Fermentas公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自上海華舜生物工程公司；質粒提?。ㄐ×浚┰噭┖匈徸蕴旄萍迹ū本┯邢薰尽?/p>

1.2 方法

1.2.1 反義片段的克隆 對本課題組已克隆的甘藍型油菜MYB4基因家族（MYB4-1至MYB4-4，詳細結果待發表）各成員全長序列進行多重比對，根據該基因家族特異的保守區設計引物：FMYB4A（5′-GAGCTCAGAATCAGCCTTCCTGAT-3′）和RMYB4A（5′-GGATCCTCTAGAGATTCGCTACGT-3′），上、下游引物的5′端分別引入了SacⅠ和BamHⅠ酶切位點。以甘藍型油菜基因組DNA為模板進行PCR擴增，反應程序為：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性1 min，63 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環；72 ℃延伸10 min。將PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收后與pMD18-T載體連接并測序。

1.2.2 pCambia2301G-MYB4A重組質粒的構建 采用質粒抽提試劑盒提取pMD18-T-MYB4A質粒，分別用BamHⅠ/SacⅠ雙酶切pMD18-T-MYB4A質粒和植物表達中間載體pCambia2301G。采用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并利用膠回收試劑盒回收目標片段。將回收的目標片段用T4 DNA連接酶16 ℃連接4 h后，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，提取質粒，并用BamHⅠ/SacⅠ雙酶切鑒定。

1.2.3 pCambia2301G-MYB4A重組質粒轉化根癌農桿菌 根癌農桿菌LBA4404感受態細胞的制備參照文獻[9]，將5 μL重組質粒采用液氮冷激法轉化根癌農桿菌LBA4404，涂布于含有100 mg/L Kan、40 mg/L Rif、20 mg/L Str的LB平板，28 ℃倒置培養2 d，挑取菌落接種于含相同抗生素的LB液體培養基中培養，菌液提取質粒BamHⅠ/SacⅠ雙酶切鑒定，將陽性菌保存于-80 ℃。

2 結果與分析

2.1 反義片段的克隆

以FMYB4A/RMYB4A引物、基因組DNA模板，PCR擴增反義片段后，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后出現了1條與預期大小相符的目的片段（圖1），回收該目的片段后連接pMD18-T載體轉化DH5α，挑選單菌落測序驗證。

2.2 反義表達植物載體的構建與鑒定

BamHⅠ/SacⅠ雙酶切pMD18-T-MYB4A，酶切后產生467 bp的MYB4A目的片段和約2.7 kb的pMD18-T載體骨架條帶（圖2）。對pCambia2301G質粒同樣進行BamHⅠ/SacⅠ雙酶切，切去1.9 kb的GUS基因后回收約12 kb的pCambia2301G載體骨架，然后將其與MYB4A目的片段進行連接，得到重組質粒pCambia2301G-MYB4A。pCambia2301G-MYB4A重組質粒轉化DH5α，用BamHⅠ/SacⅠ進行雙酶切鑒定（圖3）。結果表明，反義片段MYB4A已定向克隆到中間載體pCambia2301G中，成功替換其中的GUS基因，形成了反義植物表達載體pCambia2301G-MYB4A，反義片段MYB4A由CaMV35S啟動子驅動，后接Nos終止子，形成表達盒。

2.3 pCambia2301G-MYB4A重組質粒轉化根癌農桿菌

將構建好的植物表達載體的質粒轉化根癌農桿菌LBA4404的感受態后，得到抗Kan+Rif+Str的陽性克隆，參照大腸桿菌克隆子同樣的方法進行雙酶切（圖4）。結果表明，目的片段成功轉化進了根癌農桿菌，得到了pCambia2301G-MYB4A工程菌株。

3 小結與討論

苯丙烷代謝途徑中，相關酶基因的啟動序列上都含有一些高度保守的順式作用元件，為某些轉錄因子的結合位點。因此，可通過調節木質素的合成控制轉錄因子的表達來抑制多個基因的表達。近來通過對木質素合成相關酶基因的啟動子序列分析發現，在PAL、4CL、CAD等基因的啟動子序列上都具有一個PAL盒元件，該元件與苯丙氨酸基因的表達調控有關，如MYB和Ntlim1轉錄因子的結合位點。Tamagnone等[10]、Kawaoka等[11]將這些調控苯丙酸及木質素合成代謝的轉錄因子基因MYB和Ntlim1正向或反向導入植物中，能同時調節多個相關酶的表達活性，致使植物木質素合成受阻，木質素含量下降。本研究通過對本課題組克隆的甘藍型油菜MYB4基因（MYB4-1至MYB4-4）進行多序列比對分析，結合相關MYB類轉錄因子相關文獻報道，避開MYB類轉錄因子共保守結構域，根據MYB4家族蛋白C端高度保守結構域，設計467 bp的反義片段，并構建到中間載體pCambia2301G中，替換其中的GUS基因，由CaMV35S啟動子驅動，形成了反義植物表達載體。該載體的成功構建為揭示甘藍型油菜MYB4基因家族的功能、修飾油菜苯丙烷代謝途徑相關的性狀如芥子酸、木質素、類黃酮等奠定了基礎。

參考文獻：

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