植物生長調節劑對藥用植物三分三種子萌發的影響

摘要：以藥用植物三分三（Anisodus acutangulus C. Y. Wu et C. Chen ex C. Chen et C. L. Chen）成熟種子為材料，采用L9（34）正交試驗研究赤霉素（GA3）、吲哚乙酸（IAA）、6-芐基腺嘌呤（6-BA）及浸種時間對三分三種子萌發的影響。結果表明，三分三種子萌發的最佳處理是A2B3C1D2，即赤霉素200 mg/L+ 6-芐基腺嘌呤20 mg/L+吲哚乙酸0 mg/L+浸種時間24 h，該處理的種子發芽率高達97.8%以上，并且種子開始發芽時間、發芽持續時間較短，種子發芽勢、發芽指數最高，是比較理想的種子萌發處理方法。對發芽率進行極差分析以及驗證試驗的結果顯示，影響三分三種子發芽率的最佳處理是A3B2C3D1，即赤霉素800 mg/L+ 6-芐基腺嘌呤10 mg/L+吲哚乙酸10 mg/L+浸種時間12 h；4種因素中以浸種時間對三分三種子發芽率的影響最大，其次是6-芐基腺嘌呤、吲哚乙酸，影響最小的是赤霉素，說明浸種時間過長反而對發芽不利。

關鍵詞：三分三（Anisodus acutangulus C. Y. Wu et C. Chen ex C. Chen et C. L. Chen）； 植物生長調節劑；正交試驗；種子；發芽

中圖分類號：Q949.777.7；S482.8；S11+4 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）14-3361-03

三分三（Anisodus acutangulus C. Y. Wu et C. Chen ex C. Chen et C. L. Chen）為茄科（Solanaceae）山莨菪屬（Anisodus Link et Otto）多年生草本植物，別名大搜山虎、山野煙、野煙、山茄子等，僅分布于云南省西北部，生長于2 700～3 600 m的高海拔地區山坡、草叢或灌木叢中[1]。三分三主要以根、莖、葉及種子入藥，有大毒，具有麻醉鎮痛、祛風除濕的功效，可治療骨折、跌打損傷、關節疼痛、胃痛、腸絞痛等病癥。三分三的根莖中含有多種托品烷類生物堿，主要是莨菪堿、山莨菪堿、中莨菪堿、東莨菪堿以及微量托品堿[2]，這些生物堿中的莨菪堿、東莨菪堿是反副交感神經作用類藥物，臨床上主要用作鎮靜劑使用[3]。三分三是云南省民間的珍稀藥用植物，由于野生資源分布范圍狹窄、生長環境惡劣，野生資源極其有限。以往民間用藥主要靠野外挖掘，但經過長期無序采挖，野生種質資源瀕臨滅絕。為此有研究者采用植物組織培養技術試圖在實驗室生產三分三所含的藥用成分，如鄭光植等[4-7]對三分三的細胞培養生產莨菪堿和東莨菪堿進行了大量的基礎研究，潘夕春等[8]用植物組織培養技術誘導三分三的根生產托品烷類生物堿；但這些學者對三分三細胞培養和組織培養生產托品烷類生物堿的探索還處在實驗室階段，離工業化生產還有很長的距離，因此通過人工種植三分三仍然是目前解決三分三藥材來源的有效途徑。種子萌發是開展藥材種植的基礎，現在國內還未見對三分三種子發芽的研究報道，本課題組在前期已經對三分三種子的萌發進行過發芽比較試驗，發現三分三種子的萌發率不到50%。為了提高三分三種子的萌發率，試驗采用植物生長調節劑赤霉素（Gibberellic acid，GA3）、吲哚乙酸（Indole-3-acetic acid，IAA）、6-芐基腺嘌呤（6-benzyl aminopurine，6-BA）處理三分三種子，進一步研究了三分三種子的萌發特性，以期為三分三種子育苗、人工種植提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試三分三種子于2011年秋季采集于云南省大理市喜洲鎮花甸藥材種植基地，采收后曬干、去除雜質，用棉布包裹后置于室內通風處保存。植物生長調節劑赤霉素、吲哚乙酸、6-芐基腺嘌呤均為市售，試劑主要有升汞、乙醇，儀器主要是SPX-250B-D型振蕩培養箱（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）。

1.2 正交試驗設計

試驗參照東林等[9]建立的方法，設計了L9（34）正交試驗方案，4個因素、3個水平分別是因素A：赤霉素，3個濃度水平分別為40、200、800 mg/L；因素B：6-芐基腺嘌呤，3個濃度水平分別為5、10、20 mg/L；因素C：吲哚乙酸，3個濃度水平分別為0、5、10 mg/L；因素D：浸種時間，3個用時水平分別為12、24、48 h；具體的因素水平組合見表1。比較各組合對三分三種子萌發的影響，并根據正交試驗的結果進行驗證培養試驗。

1.3 發芽方法

發芽試驗于2011年11月至2012年6月在大理學院藥物研究所完成。三分三種子發芽方法參考文獻[10]和[11]的規程。在實驗室將三分三種子用0.1%的升汞溶液消毒殺菌8～10 min，再用去離子水沖洗，晾干。種子萌發在直徑為16 cm培養皿里完成，培養皿經自來水沖洗、75%乙醇消毒、去離子水洗滌、晾干后，在皿內鋪3層干凈濾紙作為種子的發芽床，每個培養皿放入經過消毒的三分三種子30粒，每處理（因素水平組合）3次重復。各處理種子都放入振蕩培養箱中，在25 ℃恒溫、光照環境下培養，培養過程中注意保持濾紙的濕潤狀態。

1.4 發芽指標

試驗以三分三種子的胚根長度≥2 mm作為種子發芽標準，在試驗期間每天記錄種子萌動數，種子發芽試驗結束后統計發芽開始時間、發芽持續時間、平均發芽數，計算種子發芽率、發芽勢和發芽指數。

三分三種子發芽率=（發芽期間內能夠形成胚根或胚芽的種子數/供試種子數）×100%；

三分三種子發芽勢=（到達發芽持續天數一半時的發芽種子數/供試種子數）×100%；

三分三種子發芽指數GI=∑Gt/Dt。

式中，Dt為發芽時間，Gt為相應時間t的正常發芽數。所得試驗數據采用正交設計助手Ⅱ軟件[10]進行分析。

2 結果與分析

三分三種子室內發芽試驗結果顯示，在播種2～4 d后三分三種子胚根突破種皮萌發，6～10 d胚突破種皮形成子葉。4因素、3水平L9（34）正交試驗對三分三種子萌發的影響結果見表2。分析表2可知，各因素水平組合以A2B3C1D2對三分三種子萌發的影響最大，即赤霉素200 mg/L+ 6-芐基腺嘌呤20 mg/L+吲哚乙酸0 mg/L+浸種時間24 h的處理發芽率為97.8%，是所有處理里最高的；并且種子開始發芽的時間為4 d，發芽的持續時間為5 d，發芽勢為90.0%，發芽指數達到了6.8，發芽勢和發芽指數是所有處理里最高的，因此是試驗范圍內較理想的三分三種子萌發處理方法。另外，因素水平組合A2B2C3D1（赤霉素200 mg/L+ 6-芐基腺嘌呤10 mg/L+吲哚乙酸10 mg/L+浸種時間12 h）的發芽率也是97.8%，發芽勢也為90.0%，種子開始發芽的時間為3 d，表現也是不錯的，只不過發芽指數較低。

為了進一步考察處理之間的差異，對表2中的發芽率進行了極差分析，結果見表3。由極差分析可知，從發芽率的角度考慮，影響三分三種子發芽的最佳處理是A3B2C3D1，即赤霉素800 mg/L+6-芐基腺嘌呤10 mg/L+吲哚乙酸10 mg/L+浸種時間12 h；并且各因素中以浸種時間對三分三種子發芽率的影響最大，其次是6-芐基腺嘌呤、吲哚乙酸，影響最小的是赤霉素，說明浸種時間過長反而對種子發芽不利。用最佳因素水平組合A3B2C3D1處理三分三種子進行萌發驗證試驗，結果該處理的發芽率高達99.2%，證明A3B2C3D1確實是效果最好的處理，也說明試驗結果是可靠的。

3 小結

植物種子萌發技術是開展育苗與種植的基礎，東林等[9]用植物生長調節劑赤霉素、吲哚乙酸、6-芐基腺嘌呤處理堅龍膽（Gentiana rigescens Franch.ex Hemsl.）種子，結果可以顯著提高種子的發芽率，本試驗結果與之相似。通過L9（34）正交試驗，表明赤霉素、吲哚乙酸、6-芐基腺嘌呤、浸種時間4個因素對三分三種子發芽率的影響非常明顯，其中浸種時間對三分三種子發芽率的影響最大，其次是6-芐基腺嘌呤、吲哚乙酸，影響最小的是赤霉素；最佳處理是赤霉素800 mg/L+6-芐基腺嘌呤10 mg/L+吲哚乙酸10 mg/L+浸種時間12 h。下一步將對三分三種子發芽后在土壤中的生長情況及成苗率等育苗全程做系統研究。

參考文獻：

[1] 吳懷瑜.大理市中藥資源志[M].昆明：云南民族出版社，1991.64.

[2] XIAO P G， XIAO G C， HE L Y. The occurrence of some important tropane alkaloids in Chinese Solanaceous plants [J]. J Integr Plant Biol，1973，15：187-194.

[3] YAMADA Y， TABAT M. Plant biotechnology of tropane alkaloids[J].Plant Biotechnol，1997，14：1-10.

[4] 鄭光植，梁 崢.藥用植物組織培養的研究Ⅰ. 三分三愈傷組織的培養及莨菪堿和東莨菪堿的產生[J].植物學報，1976，18（2）：163-169.

[5] 鄭光植，梁 崢.藥用植物組織培養的研究Ⅱ. 三分三愈傷組織的生長、莨菪堿和東莨菪堿合成的化學調控[J].植物學報，1977，19（3）：209-215.

[6] 鄭光植，何靜波，王世林.藥用植物組織培養的研究Ⅳ. 三分三細胞培養中的激素調控[J].植物學報，1982，24（1）：129-134.

[7] 鄭光植，何靜波，王世林.藥用植物組織培養的研究Ⅴ. 三分三愈傷組織細胞的懸浮培養[J].云南植物研究，1982，4（2）：203-206.

[8] 潘夕春，陳 敏，張 磊，等.植物表達載體在三分三發根中的高效表達[J].中草藥，2007，38（4）：588-591.

[9] 東 林，李海峰.植物激素對堅龍膽種子萌發的影響[J].安徽農業科學，2012，40（12）：7100，7206.

[10] 顏啟傳.種子學[M].北京：中國農業出版社，2001.

[11] 國際種子檢驗協會.國際種子檢驗規程[S].顏啟傳，畢辛華，譯.北京：農業出版社，1985.