殼聚糖季銨鹽抗植物病原真菌活性的研究

摘要：以2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨（EPTAC）作為改性劑成功合成了具有良好水溶性的殼聚糖季銨鹽（HTCC）；通過傅立葉紅外圖譜（FT-IR）、氫核磁共振（1H NMR）對(duì)其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征；研究HTCC在不同濃度、pH、金屬離子條件下對(duì)花生尾孢菌（Cercospora arachidicola）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、蘋果輪紋病菌（Botryosphaeria berengriana）、可可刺盤孢（Colletotrichum coccodes）4種植物病原真菌的抗菌活性；對(duì)其抗真菌機(jī)理進(jìn)行了初探。結(jié)果表明，2.0 mg/mL的 HTCC對(duì)花生尾孢菌、蘋果輪紋病菌的抑菌率達(dá)74.8%和71.8%；pH是影響抗菌活性的一個(gè)重要因素；除蘋果輪紋病菌外，HTCC對(duì)其他病菌的抑菌率在加入金屬離子后均增加，Mg2+、Ca2+的加入使抑菌率達(dá)100%；HTCC處理能引起菌絲體蛋白質(zhì)和核酸外泄。

關(guān)鍵詞：殼聚糖；殼聚糖季銨鹽（HTCC）；抗真菌活性；機(jī)理

中圖分類號(hào)：TS202.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）14-3306-04

隨人們對(duì)食品安全和環(huán)境安全的重視，開發(fā)新型無毒無害的農(nóng)用抗菌劑成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)之一。殼聚糖（CTS）作為一種綠色環(huán)保抗菌劑而受到國內(nèi)外持續(xù)關(guān)注和研究。殼聚糖是自然界中惟一的堿性多糖[1]，不僅來源豐富，而且具有安全無毒、生物相容性好、可生物降解、防腐抗菌[2]、無免疫源性[3]等生物學(xué)性能和制粒、拉絲、成膜[4]、吸濕保濕[5]等理化特性，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化工、農(nóng)業(yè)以及生物工程等領(lǐng)域[6]。但是，殼聚糖不溶于水的性質(zhì)限制了其進(jìn)一步應(yīng)用。試驗(yàn)通過烷基化改性殼聚糖制得了水溶性的殼聚糖季銨鹽（HTCC），采用傅立葉紅外圖譜（FT-IR）、氫核磁共振（1H NMR）對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征；選取花生尾孢菌（Cercospora arachidicola）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、蘋果輪紋病菌（Botryosphaeria berengriana）、可可刺盤孢（Colletotrichum coccodes）4種農(nóng)作物易感病原真菌作為測試菌種，研究了不同濃度、pH、金屬離子條件下殼聚糖季銨鹽的抗真菌性能，并初步探索其抗菌機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試劑

殼聚糖（脫乙酰度90%），購自天津市久康生物工程有限公司；2，3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨（EPTAC），購自上海笛柏化學(xué)品技術(shù)有限公司；異丙醇、乙醇、醋酸等試劑均為市售分析純，水為雙蒸水。

1.2 菌種

花生尾孢菌、立枯絲核菌、蘋果輪紋病菌、可可刺盤孢，河北工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院生物工程系保藏。

1.3 HTCC的合成與表征

6 g殼聚糖（粘均相對(duì)分子質(zhì)量為2×104）加入到54 mL異丙醇中，攪拌均勻，水浴加熱至60 ℃，加入60 mL 370 mg/mL 的EPTAC溶液，水浴升溫至80 ℃，反應(yīng)10 h，離心、棄上清液，沉淀經(jīng)80%異丙醇洗滌，離心，取沉淀凍干即為HTCC。HTCC用KBr壓片，使用TENSOR 27型紅外光譜儀（德國Bruker Optics公司）對(duì)HTCC進(jìn)行紅外光譜分析；使用AVANCE 400型核磁共振波譜儀（瑞士Bruker Biospin公司）對(duì)HTCC進(jìn)行氫核磁共振分析。

1.4 HTCC抗植物病原真菌活性測定

1.4.1 不同濃度HTCC抗真菌活性的分析 PDA培養(yǎng)基中加入HTCC醋酸緩沖液（pH 5.0），使培養(yǎng)基中HTCC終濃度依次為0.0（對(duì)照，CK）、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL。培養(yǎng)基中央貼直徑6 mm的菌餅，27 ℃培養(yǎng)，定時(shí)測量菌落直徑，計(jì)算抑菌率（IR）。

1.4.2 pH對(duì)HTCC抗真菌活性的影響 配制pH為4.0、5.0、6.0、7.0的 HTCC終濃度為0.5 mg/mL的PDA培養(yǎng)基，貼菌餅培養(yǎng)5 d，測定抑菌率。以不加HTCC的相同pH的PDA培養(yǎng)基為對(duì)照（CK）。

1.4.3 金屬離子對(duì)HTCC抗真菌活性的影響 PDA培養(yǎng)基中分別加入HTCC醋酸緩沖液（pH 5.0）和K+、Na+、Ca2+、Mg2+金屬離子，使金屬離子終濃度為1 mmol/mL，HTCC終濃度為0.2 mg/mL。貼菌餅培養(yǎng)7 d，測定菌落直徑，計(jì)算抑菌率。

1.4.4 抑菌率計(jì)算 抑菌率=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑） × 100%。

1.5 HTCC抗植物病原真菌機(jī)理研究

取液體培養(yǎng)3 d的C. arachidicola菌絲4 g（濕重），用0.9%的NaCl溶液洗滌，懸浮于40 mL磷酸緩沖液（pH 7.2，含0.8 mg/mL HTCC）中，27 ℃振蕩溫育。定時(shí)測定280 nm和260 nm的吸光值（A）。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)處理采用SPSS軟件輔助進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 HTCC的結(jié)構(gòu)特性與分析

2.1.1 FT-IR分析結(jié)果 殼聚糖在1 651 cm-1處的吸收峰為其分子中-NH2的彎曲振動(dòng)峰[7]，此峰在HTCC中消失（圖1），說明改性后的殼聚糖分子中的-NH2發(fā)生了改變；而HTCC在1 483、1 647 cm-1處出現(xiàn)兩個(gè)新的吸收峰（圖1），分別表示HTCC分子中季銨基團(tuán)中-CH3的變形振動(dòng)峰和伸縮振動(dòng)峰[8]。該結(jié)果說明殼聚糖中的-NH2被烷基取代，合成了HTCC。

2.1.2 1H NMR分析結(jié)果 HTCC的氫核磁共振譜圖中在δ=3.176處出現(xiàn)強(qiáng)吸收峰（圖2），為HTCC分子中-N+（CH3）3上H-d的吸收峰[9]；在δ=2.720、4.498、2.502處出現(xiàn)了3個(gè)弱的吸收峰（圖2），分別為HTCC支鏈上H-a、H-b、H-c的吸收峰[10]。氫核磁共振譜圖進(jìn)一步證實(shí)試驗(yàn)成功合成了HTCC。

2.2 HTCC抗植物病原真菌活性

2.2.1 不同濃度HTCC抗真菌活性 HTCC對(duì)4種病原真菌均具有一定的抑制效果，并且隨HTCC濃度的增加、作用時(shí)間的延長，抑菌率均有所提高（圖3）。對(duì)于C. arachidicola，當(dāng)所用HTCC的濃度為0.5 mg/mL時(shí)，試驗(yàn)時(shí)間內(nèi)最終的抑菌率達(dá)64.8%，而當(dāng)HTCC的濃度為2.0 mg/mL時(shí)，最終的抑菌率高達(dá)74.8%；對(duì)于B. berengriana，當(dāng)HTCC的濃度為2.0 mg/mL時(shí)，最終的抑菌率為71.8%。HTCC對(duì)R. solani、C. coccodes的抑制作用稍差，但當(dāng)HTCC的濃度為2.0 mg/mL時(shí)，最終抑菌率也超過50.0%。

2.2.2 pH對(duì)HTCC抗真菌活性的影響 不同pH下HTCC對(duì)4種真菌的抗菌效果見表1。對(duì)于C. arachidicola、B. berengriana，隨pH增加，HTCC抗菌性增強(qiáng)。Qin等[11]的研究表明HTCC對(duì)E. coli、S. aureus在弱堿環(huán)境下的抗菌性優(yōu)于弱酸環(huán)境，本研究對(duì)C. arachidicola、B. berengriana試驗(yàn)結(jié)果趨勢與之相近。對(duì)于R. solani、C. coccodes則是在pH 5.0時(shí)抑菌率較大。試驗(yàn)結(jié)果表明HTCC氨基組的正電荷并不是其發(fā)揮抗菌活性的惟一原因，HTCC抗菌性能可能與測試菌株自身對(duì)HTCC的敏感性及對(duì)pH的耐受程度有關(guān)系。

2.2.3 金屬離子對(duì)HTCC抗真菌活性的影響 金屬陽離子對(duì)HTCC抗真菌效果的影響見圖4。由圖4可見，金屬離子的加入顯著增強(qiáng)了HTCC對(duì)R. solani、C. coccodes、C. arachidicola的抗菌活性，尤其是二價(jià)陽離子Ca2+、Mg2+加入后HTCC的抑菌率高達(dá)100%。此外，對(duì)于R. solani、C. coccodes，在加入K+、Na+后HTCC的抑菌率也達(dá)到100%。而對(duì)于B. berengriana， K+、Na+的加入使HTCC的抑菌率不同程度地降低，Ca2+、Mg2+的加入使其抑菌率有所增加。金屬離子對(duì)HTCC抗真菌活性的影響較大，適當(dāng)選擇添加離子，在較低濃度下可大幅提高HTCC抗植物病原真菌的性能。

2.3 HTCC抗植物真菌機(jī)理

HTCC處理C. arachidicola菌絲體后，溶液的280、260 nm吸光值都有所增加，說明引起了菌絲體蛋白質(zhì)和核酸的泄露（圖5）。菌絲體內(nèi)容物的泄漏，推測主要是由于菌絲體細(xì)胞膜和細(xì)胞壁受到了部分破壞。真菌的細(xì)胞壁含有幾丁質(zhì)[12]，高濃度的殼聚糖激活了幾丁質(zhì)酶，進(jìn)而導(dǎo)致真菌自身降解細(xì)胞壁，從而裸露細(xì)胞膜，抑制了真菌的生長[13]。另有研究[14]認(rèn)為，殼聚糖處理R. stolonifer后造成了細(xì)胞膜上位點(diǎn)被破壞，形成小孔隙。此外，有文獻(xiàn)[15，16]報(bào)道HTCC為一種聚陽離子殺菌劑，擁有正電荷，而細(xì)菌、真菌細(xì)胞表面帶負(fù)電荷，二者可以形成復(fù)合物，使膜的流動(dòng)性、滲透性發(fā)生改變，從而起到抑菌效果。

3 結(jié)論

試驗(yàn)得到了水溶性的殼聚糖季銨鹽，克服了殼聚糖不溶于水的應(yīng)用限制。合成的殼聚糖季銨鹽在濃度為2.0 mg/mL時(shí)，對(duì)C. arachidicola、B. berengriana的抑菌率高達(dá)74.8%和71.8%，在較低濃度下添加Ca2+、Mg2+可以使HTCC對(duì)C. arachidicola、R. solani、C. coccodes的抑菌率高達(dá)100%。HTCC作為一種環(huán)境友好型抗菌劑，可以探索其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。

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