麻核桃CBF基因的克隆與生物信息學分析

摘 要：CBF基因是植物CBF抗冷途徑的樞紐，對增強植物抗冷能力極為重要。本研究根據已知的核桃CBF基因序列設計通用性引物，對麻核桃cDNA進行PCR擴增，成功獲得麻核桃CBF基因全長序列，命名為JhCBF。JhCBF全長820 bp，包含一個645 bp的開放讀碼框（ORF），編碼214個氨基酸。序列分析表明JhCBF與其他物種來源的CBF具有較高的同源性，其中，與樺木科白樺的同源性最高，為6122%；JhCBF含有一個預測的AP2結構域及CBF特有的兩段短肽序列。系統進化樹分析表明JhCBF與樺木科白樺的親緣關系最近，最先聚為一類。

關鍵詞：麻核桃；CBF基因；克隆；生物信息學分析

中圖分類號：Q785 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2013）11-0007-05

麻核桃（Juglans hopeiensis Hu）屬胡桃科（Juglandaceae）胡桃屬（Juglans），主要分布在河北、天津、山西和北京的部分山區。麻核桃集紋路多變、皮質良好、造型優美等優點于一身，在文玩核桃中屬于最高檔次的品種。低溫凍害是影響核桃生長發育、造成核桃產量和質量下降的主要因素之一。南方的泡核桃引種到北方種植時，多數因低溫脅迫致死，而我國獨有的麻核桃能夠在河北、北京等山區林地正常生長，因此，對麻核桃的抗寒性進行研究具有重要的理論和實踐意義。

CBF（CRT/DRE-binding factor）基因是一種低溫響應轉錄因子基因，其主要的抗冷機制為：當植物受低溫馴化后，ICE（Inducer of CBF expression）轉錄因子被激活，與位于CBF基因上游啟動子中的ICE盒相結合，誘導CBF基因表達，而后CBF基因表達產物與下游一系列COR（Cold-regulated gene）基因啟動子中的CRT/DRE（C-repeat binding factor /dehydration-responsive element binding protein）元件結合，誘導系列抗冷基因表達，從而提高植物抗冷性[1]。自1997年Stockinger等[2]在擬南芥中克隆到CBF1基因以來，之后相繼從油菜[1，3]、水稻[4]、大麥[5]等多種作物中分離和鑒定出CBF轉錄因子基因。迄今為止，在櫻桃[6]、楊樹[7，8]、葡萄[9]、柑橘[10]、榛子[11]等多種木本植物中也已克隆得到CBF基因。研究表明，CBF基因過量表達或異源表達能增加下游抗冷功能基因的表達，增加抗寒代謝物（包括抗氧化物質和滲調物質等）的積累量從而對提高植物的抗寒性發揮重要作用[12～14]。本試驗根據已公布的核桃CBF基因序列設計通用引物，成功克隆JhCBF基因，并對其進行生物信息學分析，為JhCBF基因的進一步研究奠定基礎。

1 材料與方法

11 材料與試劑

EASYspin植物RNA快速提取試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司；DNA凝膠回收試劑盒、RNase-Free DNaseⅠ和Mix均購自天根公司；引物及克隆載體pMD19-T Vector購自寶生物（大連）有限公司；反轉錄試劑盒購自Thermo Scientific公司。

12 試驗方法

。

2 結果與分析

21 麻核桃CBF基因cDNA全長的獲得

以麻核桃cDNA為模板，用通用引物進行PCR擴增，獲得了長約820 bp的特異性條帶（圖1）。將測序結果在NCBI網站進行Blast比對發現，該cDNA序列與已注冊其他植物的CBF基因具有較高的同源性，命名為JhCBF。JhCBF cDNA全長820 bp，包含一個645 bp的開放讀碼框（ORF），編碼214個氨基酸。在第149個核苷酸處有起始密碼子ATG，在第791個核苷酸處有終止密碼子TAG（圖2）。

22 JhCBF編碼蛋白序列分析及系統進化樹構建

3 結論 本研究首次獲得了麻核桃CBF基因的全長cDNA，并對其進行了生物信息學分析，揭示出CBF在核桃種屬之間保守存在。本研究為下一步深入探討JhCBF基因的功能，揭示麻核桃響應低溫脅迫的分子機制提供了基礎，為增強核桃的抗寒性及培育具有抗寒能力的核桃新品種提供理論依據。下一步將抗寒基因與傳統抗冷育種技術相結合，培育抗冷植物新品種，對農業生產具有十分重要的意義。

參 考 文 獻：

[1] Zhou N， Wu G， Gao Y P， et al Molecular cloning of a cDNA encoding dehydration responsive element （DRE）binding protein in Brassic napus NCBI GenBank accession number AF084185 [DB/OL] http：//www ncbinlm.nih gov./， 1998

[2] Stochinger E J， Gilmour S J， Thomashow M F Arabidopsis thaliana CBF1 encodes an AP2 domain-containing transcription activator that binds to the C-repest/DRE， a cis-acting DNA regulatory element that stimulates transcription in response to low temperature and water deficit [J] Proc Natl Acad Sci USA， 1997， 94（3）：1035-1040

[3] Jaglo-Ottosen K R， Kleff S， Amundsen K L， et al Components of the ArabidopsisC-repeat/dehydration-responsive element binding factor cold-response pathway are conserved in Brassica napus and other plant species[J] Plant Physiology， 2001， 127（3）： 910- 917

[4] Choi D W， Close T J. Rice（Oryza sativa cv Somegawa）DRE/CRT binding fator（CBF） NCBI GenBank accession number AF243384 [DB/OL] http：//www ncbinlm.nihgov./， 2000

[5] Choi D W， Close T J Isolation of CBF1-like mRNA（BCBF1）from Barley（Hordeum vulgare cv Morex） NCBI GenBank accession number AF298230 [DB/OL] http：//www ncbinlm.nihgov./， 2000

[6] Owens C L， Thomashow M F， Hancock J F， et al CBF orthologs in sour cherry and strawberry and the heterologous expression of CBF1 in strawberry[J] J Amer Soc Hort Sci， 2002， 127（4）： 489-494

[7] Benedict C， Skinner J S， Meng R， et al The CBF1-dependent low temperature signalling pathway， regulon and increase in freeze tolerance are conserved in Populus spp[J] Plant Cell Environ， 2006，29（7）： 1259-1272

[8] 周 洲，李永麗 毛白楊轉錄因子PtCBF5的表達模式分析[J] 林業科學， 2010，46（4）：58-63

[9] Xiao H， Siddiqua M， Braybrook S， et al Three grape CBF/DREB1 genes respond to low temperature， drought and abscisic acid [J] Plant Cell Environ， 2006，29（7）： 1410-1421

[10]Champ K I， Febres V J， Moore B D The role of CBF transcriptional activators in two Citrus species （Poncirus and Citrus） with contrasting levels of freezing tolerance[J] Physiologia Plantarum， 2007， 129（3）： 529-541

[11]陳 新，王貴禧，梁麗松， 等 平榛冷適應相關基因CBF的克隆及時空表達特性分析[J] 林業科學，2012， 48（1）：167-172

[12]Gilmour S J， Zarka D G， Stockinger E J， et al Low temperature regulation of the Arabidopsis CBF family of AP2 transcriptional activators as an early step in cold-induced COR gene expression[J] The Plant Journal， 1998， 16（4）：433-442

[13]嚴海燕，Steponkuspl CBF3基因過量表達的擬南芥細胞質膜組分的變化[J] 武漢植物學研究，2004，22（6）： 529-533

[14]金建鳳，高 強，陳 勇， 等 轉移擬南芥CBF1基因引起水稻植株脯氨酸含量提高[J] 細胞生物學雜志，2005， 27： 73-76

[15]Okamuo J K， Caster B， Villarroel R， et al The AP2 domain of APETALA2 defines a large new family of DNA binding proteins in Arabidopsis[J] Proc Natl Acad Sci USA， 1997， 94（13）：7076-7081

[16]李利斌，劉立鋒，王殿峰，等.大白菜CBF4基因的克隆和遺傳進化分析[J].山東農業科學， 2009，4：1-4.

[17]Medina J， Bargues M， Terol J， et al The Arabidopsis CBF gene family is composed of three genes encoding AP2 domain-containing proteins whose expression is regulated by low temperature but not by abscisic acid or dehydration[J] Plant Physiology， 1999， 119（2）：463-470

[18]Allen M D， Yamasaki K， Ohme-Takagi M， et al A novel mode of DNA recognition by a β-sheet revealed by the solution structure of the GCC-box binding domain in complex with DNA [J] EMBO J， 1998， 17（18）：5484-5496