生姜拮抗性內生細菌的篩選

摘 要：從樂山市售生姜根狀莖中分離純化內生細菌，并以金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、大腸桿菌 （Escherichia coli （E.coli））、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA）為靶標菌進行抑菌試驗。研究結果表明：生姜中存在大量的內生細菌，分離獲得的9個菌株對四種靶標菌都有不同程度的抑菌作用，2個菌株（SJ1 and SJ9）抑菌效果非常顯著，相對抑菌率超過170%。

關鍵詞：生姜 內生細菌 分離 拮抗作用 篩選

中圖分類號：S476 文獻標識碼：A 文章編號：1672-3791（2013）04（c）-0154-03

生姜（Zingiber officinale Roscoe）在中藥中是一種很重要的藥用植物，由于其性辛辣的特點，有發汗、驅寒、止嘔、解毒等多種功能[1]，生姜中的一些代謝產物還具有良好的降膽固醇、抑菌、抗衰老、抗癌、防血凝、抗氧化及防腐等作用，如姜黃、姜精油[2]。生姜內生細菌是指存在于生姜組織和器官內部的細菌，根據相似相溶原理，生姜內生細菌可能具有生姜相同的抑菌效果[3]，可作為重要的天然抑菌材料來源進行研究。

由于生姜的病變很少，本研究基于生姜內生細菌可能具有抑菌功效的思想，從生姜組織中分離純化內生細菌，并篩選對金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、大腸桿菌 （Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA）有抑菌作用的菌株，為利用植物內生細菌資源開發抑菌新藥物提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

從樂山各市場購買市售食用生姜。

1.2 靶標菌

S.aureus、E.coli、B.subtilis、MRSA，由本校病理實驗室提供。

1.3 培養基

馬鈴薯葡萄糖培養基（分離純化培養基）：馬鈴薯200 g，葡萄糖5 g，瓊脂粉16 g，純凈水1000 ml，pH自然[4]。

馬鈴薯瓊脂培養基（PDA）（拮抗篩選培養基）：馬鈴薯200 g，削皮煮汁，葡萄糖5 g，瓊脂粉20 g，水1000 ml，pH7.0[5]。

1.4 生姜內生菌的分離純化

生姜的表面消毒：取無病無霉變的完整生姜塊根（約30 g），用自來水沖洗5 min，沖洗表面的泥土等污物，放于已滅菌的培養皿中，無菌水反復沖洗3～5次，5%次氯酸鈉洗滌3次，無菌水沖洗3～5次，收集最后一次沖洗液做無菌檢驗[6]。

分離純化：在無菌條件下，分別用滅菌后的解剖刀切割表面消毒完全的生姜塊根成直徑為0.5 cm方形的小塊，用無菌鑷子將姜塊放于馬鈴薯葡萄糖培養基上不同的地方，每個平板均勻擺放3～4塊，置于28 ℃培養，每隔12 h觀察一次，培養2～3 d時間。待培養皿上出現單菌落時，根據菌落的形態、顏色、大小將其分類后采用平板劃線法接種到新鮮平板上培養，直到獲得單菌落為止[7～8]，純化后的菌株保存于斜面中備用。

1.5 平板對峙法初篩

內生細菌活化后涂布接種在平板上培養24 h后，在無菌條件下用0.5 cm打孔器制打成菌餅[9～10]，將菌餅放置于涂布接種有四種靶標菌的平板上，28 ℃培養，每隔12 h觀察一次，培養48 h后用十字交叉法測定抑菌圈的大小[11～12]，每處理重復三次，以無菌的培養基打孔代替菌餅做為對照（CK）[13]。相對抑菌率（%）=（抑菌圈直徑-菌餅直徑）/菌餅直徑×100%。

1.6 牛津杯法復篩

直接垂直插上已滅菌的牛津杯，輕輕加壓（注意不能與培養皿底部接觸）[14]，使其與培養基接觸無空隙，每個平板插4個牛津杯，將初篩中有拮抗活性的菌株菌懸液100 ul加入到牛津杯中，置28 ℃培養48 h[15]，十字交叉法測量抑菌圈直徑大小，記錄數據。每種處理重復三次，以向牛津杯中加入100 ul的無菌水代替菌懸液做為對照（CK）。相對抑菌率（%）=（抑菌圈直徑-菌餅直徑）/菌餅直徑×100%。

2 結果與分析

2.1 生姜內生細菌的分離純化

通過反復分離純化，并按照菌落、菌株形態、大小、顏色等特征進行區分，共獲得9株可培養的內生細菌，依次編號為SJ1-SJ9。

2.2 拮抗菌株的初篩

對分離純化得到的9株生姜內生菌菌株進行了皿內對峙法拮抗試驗，9個菌株均具有不同程度的抑菌效果，其中有7個菌株對四種病原細菌的抑菌圈直徑均大于12.5mm，相對抑菌率均超過150%（如表1）。

2.3 拮抗功能菌株得復篩

對初篩得到的7個菌株進行牛津杯法復篩，結果表明7個菌株對四種病原細菌都有不同程度的抑菌效果，其中SJ1和SJ9的抑菌效果比較明顯，對四種病原細菌的抑菌圈直徑超過13 mm，相對抑菌率超過170%（表2）。

3 結論與討論

（1）因生姜內生細菌大多數具有抑菌作用，其中SJA和SJI抑菌圈的直徑大于等于13.7 mm，具有較強的抑菌效果。在初篩過程中SJA對大腸桿菌、MRSA、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑菌圈大小依次為：13.8 mm、14.5 mm、13.7 mm、13.3 mm。在復篩過程中SJA對大腸桿菌、MRSA、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌抑菌圈的大小依次為：13.7 mm、13.7 mm、13.7 mm、13.8 mm。在初篩過程中SJI對大腸桿菌、MRSA、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌抑菌圈的大小依次為：13.1 mm、12.7 mm、13.4 mm、13.2 mm。在復篩過程中SJI對大腸桿菌、MRSA、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌抑菌圈的大小依次為13.7 mm、13.8 mm、13.8 mm、13.6 mm。

（2）本試驗中，判斷抑菌作用強弱的是抑菌圈的大小，此方法具有一定的局限性，通常只能定性判斷內生細菌對靶標菌有無抑菌效果，不能確定內生細菌抑菌的機制。

（3）生姜內生細菌大多數具有很強的抑菌效果[16]，在醫學方面新藥的研發具有很高的研究價值，是一種重要的天然來源。

（4）本試驗只是對生姜莖的內生細菌進行了分離和篩選，而葉等器官沒有進行內生細菌的分離和篩選，還等進一步進行研究。

（5）本次試驗中，SJ1和SJ9初篩和復篩過程中抑菌圈大小存在差異，二者之間是否存在一定的聯系還不確定。

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