長壽命熒光探針在飲用水中病原微生物檢測前景①

摘 要：飲用水中微生物污染不斷出現，對檢測技術提出了新的挑戰。作者介紹了目前飲用水中病原微生物的種類、危害及我國飲用水微生物指標，對病原微生物的檢測方法進行了歸納，探討了長壽命熒光探針技術在飲用水中病原微生物檢測的應用前景。

關鍵詞：長壽命熒光探針 飲用水 病原微生物

中圖分類號：X835 文獻標識碼：A 文章編號：1672-3791（2013）07（c）-0132-01

環境水體的污染，直接影響著飲用水的質量，隨著水體生物污染的出現，給飲用水的安全問題提出了新的挑戰。飲用水中微生物，特別是病原體微生物的出現，給人類的生命安全帶了隱患，如2003年SARS冠狀病毒[1]等全球性生物污染的出現，使飲用水中病原微生物的檢測成為全球關注的熱點。

1 飲用水中常見的病原微生物

飲用水中有許多微生物，絕大部分微生物都是無害的，引起安全問題的主要是致病微生物，主要包括細菌、病毒、藻類、原生動物。細菌中常見的主要有傷寒桿菌、軍團菌、病原性大腸桿菌、鳥分歧桿菌復合群、螺桿菌、彎曲桿菌、霍亂桿菌等。常見病毒有腸道病毒、肝炎病毒、輪狀病毒、兔杯狀病毒等。有些藻類能產生肝毒素、神經毒素等，特別是研究發現飲用水中微囊藻毒素與肝癌發病率高度相關。原生動物主要有賈第鞭毛蟲、隱孢子蟲、環孢子蟲和微孢子蟲，它們能引起人的腹瀉、嘔吐等癥狀，嚴重者可出現生命危險。

2 我國的飲用水微生物指標

目前，世界各國無論是發達國家還是發展中國家，都把飲用水中微生物問題列在首位[2]。也制定了相關飲用水中微生物的指標：總的來說，發達國家的指標中微生物的種類要更多，要求更嚴格。這也是飲用水中微生物指標的發展趨勢。中國目前以2006年頒布的《生活飲用水衛生標準》，共6項微生物指標，包括微生物項目細菌總數、大腸桿菌、賈第鞭毛蟲、隱孢子蟲、大腸埃希菌和耐熱大腸菌群。可以看到，我國對病毒和產毒藻類并沒有強制的標準，需要在不斷的發展中修訂我國的飲用水水質標準。

3 飲用水中微生物檢測方法

隨著飲用水中微生物指標地不斷修訂，飲用水中微生物的標準檢測方法也在不斷的更新發展[3]。國家標準中規定的檢測方法主要包括：菌落總數的平板計數法，總大腸桿菌和大腸埃希氏菌的多管發酵法、濾膜法、酶底物法，耐熱大腸菌群的多管發酵法、濾膜法，賈第鞭毛蟲和隱孢子蟲的分子生物學方法。細菌的傳統的形態學檢測方法被一度認為是經典的微生物檢測方法，在我國也一直沿用至今，該方法成本低、對實驗室的硬件要求也不高，但是這種方法費時，而且對檢測人員的要求也比較高。對于原生生物的檢測也存在著方法操作復雜、檢出率低、價格昂貴等缺點。

免疫學技術特別是酶聯免疫吸附測定已經成功地用來檢測甲型肝炎病毒、脊髓灰質炎病毒等，相關的檢測試劑盒也已經商業化。免疫學技術比傳統的方法在時間上縮短了很多，但是也存在一些不足：抗體制作困難，結果受到洗滌、抗原包被過程的影響很大；另外，針對變異性快的病毒，免疫學檢測就比較困難，抗體容易失效，不能檢測新的抗原。

分子生物學的發展，是人們對微生物的檢測也發展到了分子水平。主要出現了聚合酶鏈式反應（PCR）技術、熒光原位雜交（FISH）技術和基因芯片技術。PCR技術由于其高靈敏度和特異性等特點得到了廣泛的應用，也衍生出了多種檢測方法，包括熒光定量PCR、免疫PCR等。PCR反應容易受到環境中一些物質的干擾而出現假陽性結果，并且需要得到純化的DNA或RNA片段進行擴增，步驟多，儀器昂貴，對操作人員的要求也高。FISH技術是一種安全、快速、靈敏度較高的技術，但成本較高，難以普及應用。基因芯片技術起步較晚，還不是很完善，在特異性、樣品制備等方面還存在許多問題，而且成本也比較高。這些方法還容易受到生物體系內源熒光背景和固體基質背景的干擾，檢測時靈敏度的提高受到限制。

另外，還出現了流式細胞術等檢測新技術[4]，該技術縮短了檢測時間，而且能區分活性和非活性細菌，以及估算微生物的再生能力。但是也存在一定的假陽性和假陰性率，并且使用不同熒光染料或者內標進行檢測，結果也明顯有差異，檢測費用也比較昂貴。

4 長壽命熒光標記技術

熒光分析法是一種先進的分析方法，具有儀器構造簡單、靈敏度高、選擇性好等優點而不斷地被應用在各種分析檢驗過程中。基于熒光分析原理的熒光探針技術在生命科學等領域已經起著舉足輕重的作用，由于其在檢測速度和易用性方面具有無可比擬的優點，在很多方面已經取代放射性核素標記技術而稱為標準的方法。但是熒光標記法有個最大的問題就是熒光探針容易受到生物體內源熒光和固體基質背景熒光的干擾。

長壽命熒光技術可以利用時間分辨的方法來消除內源熒光和干擾熒光，引起了國內外學者的關注而迅速發展。從20世紀80年代起，已被廣泛應用于醫學診斷、食品安全監測等領域。在微生物檢測方面，長壽命熒光標記技術也嶄露頭角，已用于快速測定食品中的大腸桿菌、微囊藻毒素、赭曲霉素A。Niu等以功能性長壽命稀土銪配合物為標記物，以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為例，建立了基于固體基質表面的雙探針串聯雜交模型，用于病原微生物DNA的檢測，并成功地對環境樣品中病源微生物進行了測定。將長壽命熒光探針技術構建高穩定性、高靈敏度、快速、簡便的飲用水中病原微生物的檢測具有重要的理論與實際意義。

參考文獻

[1]Wang Zijian，He Xiaoqing，Xie Xiang ming.Molecular technologies for monitoring pathogens in drinking water[J].J Ecotech Res，2004（10）：113-118.

[2]王中衛，李哲民.中外飲用水水質標準的微生物指標比較[J].環境監測管理與技術，2012，24（1）：70-74.

[3]金銀龍.GB 5749-2006生活飲用水衛生標準釋義[S].北京：中國標準出版社，2007：155.

[4]余輝，馬麗麗，毛冠男，等.飲用水微生物的安全快速檢測[J].微生物學通報，2012，39（8）：1171-1178.