雞胚致死孤兒病毒熒光定量PCR檢測方法的建立及初步應用

王淑菁 付 瑞 李曉波 王 吉 岳秉飛

（中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所，北京 100050）

雞胚致死孤兒病毒熒光定量PCR檢測方法的建立及初步應用

王淑菁 付 瑞 李曉波 王 吉 岳秉飛

（中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所，北京 100050）

目的：建立雞胚致死孤兒病毒CELO的熒光定量PCR檢測方法，實現該病毒在雞胚及禽源性生物制品中的快速檢測。方法 根據CELO L5 纖突1序列設計引物和探針，建立熒光定量PCR檢測方法，并對其線性、特異性、精密性、靈敏度進行考察。運用建立的方法對40份SPF雞胚尿囊液和16株流感疫苗主種子批毒種進行CELO檢測。結果：建立的熒光定量PCR其最佳線性范圍為1x109～1x104拷貝/μl，R2值達0.99以上，特異性良好，與其他種屬的腺病毒及流感病毒間均無交叉反應，靈敏度為102拷貝/μl；熒光定量PCR方法檢測40份SPF雞胚尿囊液和16株流感毒種結果為陰性。結論：本研究所建立的雞胚致死孤兒病毒熒光定量PCR檢測方法，特異性好，敏感性高，為雞胚及禽源性生物制品中的快速檢測提供了技術支撐。

雞胚致死孤兒病毒；熒光定量PCR；雞胚

雞胚致死孤兒病毒（CELO）屬于禽腺病毒I型，為無包膜雙股DNA病毒，主要引起雞的包涵體肝炎、再生障礙性貧血、呼吸道感染、出血性腸炎和產蛋量減少，常與禽類呼吸道病原微生物混合感染，導致死亡率增加[1，2，3]。2008年制定的SPF雞微生物學監測國家標準中要求SPF雞和雞胚需要排除禽腺病毒I型的感染[4]。此外，2015年版《中國藥典》中也規定流感病毒主種子毒種也需要進行外源性禽腺病毒I型的檢測，排除外源性病毒的污染[5]。

目前國標中規定的禽腺病毒I型的檢測方法是瓊脂擴散法，該方法耗時較長，敏感性差[4]。本研究旨在建立一種檢測禽腺病毒I型代表株CELO病毒的熒光定量PCR方法，能夠快速、靈敏的檢測CELO病毒。

1 材料與方法

1.1 病毒

CELO毒種（ATCC VR-432）購于ATCC；禽腺病毒III型（EDS株）購于中國獸藥監察所；小鼠腺病毒（MAdV）均購買于ATCC；猴腺病毒-1和猴腺病毒-20均為本科室保存。H1N1、H3N2、B型流感病毒為疫苗廠家送檢毒種。

1.2 主要試劑

Takara MiniBEST Viral RNA/DNA 提取試劑盒試劑盒購自TaKaRa公司；TaqMan Universal PCR Master Mix購自Applied Biosystems公司。SPF雞胚購買于北京梅里亞維通實驗動物技術有限公司。

1.3 熒光定量PCR方法的建立

1.3.1 質粒標準品的構建

擴增CELO29763-30208區域，得到446bp目的片段，測序后將目的片段轉入pMD19-T質粒中，作為CELO質粒標準品。

1.3.2 方法的建立

針對CELO六鄰體蛋白446bp保守序列設計引物和探針，引物和探針序列如下：CELO-F：CGCTTACTGCCGTTTAGCT，CELO-R：GGCATAGCTTGTCACTTGAATGGT，

探針：FAM-CCGCTGACCACGCCAC-NFQ，探針標記FAM熒光基團。引物與探針均由英俊上海公司合成部合成。PCR反應體系為：TaqMan Universal PCR Master Mix 10μl，探針引物混合物（10μM）1μl，無RNA酶水7μl，模板2μl。反應條件：50℃2min；95℃ 10min；95℃ 15s，60℃ 1min，40個循環。

1.3.3 標準曲線的繪制及最佳線性范圍的確定

建立的熒光定量PCR方法對各濃度的質粒標準品均進行考察，繪制標準曲線，并確定該方法的最佳線性范圍。

1.3.4 特異性考察

提取CELO、禽腺病毒III型EDS、鼠腺病毒，猴腺病毒-1，猴腺病毒-20、H1N1流感病毒、H3N2流感病毒、B型流感病毒的核酸DNA，進行熒光定量PCR，考察該引物和探針的特異性。

1.3.5 靈敏度考察

倍比稀釋構建的質粒標準品，從109至100拷貝/μl，每個稀釋度重復三次，考察該方法的靈敏度，以陽性檢出率為100%的最低稀釋倍數為該方法的靈敏度。

1.4 方法的應用

使用熒光定量PCR方法對40份SPF雞胚尿囊液和16株流感病毒主種子批毒種進行檢測。其中16株流感病毒毒種包括3株H1N1亞型、6株H3N2亞型、7株B亞型.

2 結果

2.1 熒光定量PCR方法的建立

2.1.1 標準曲線及最佳線性范圍：當CELO標準質粒分別在109～104拷貝/μl時，標準曲線的線性關系良好，R2值可達0.998，擴增效率為96.184%。

2.1.2 特異性：檢測結果顯示，當檢測CELO病毒時，出現FAM熒光擴增曲線。禽腺病毒III型、鼠腺病毒、猴腺病毒-1、猴腺病毒-20、H1N1流感病毒、H3N2流感病毒、B型流感病毒提取DNA樣品均無明顯擴增曲線。表明所建立的熒光定量PCR法特異性良好，與其他腺病毒及流感病毒株無交叉反應。見圖1

圖1 熒光定量PCR方法的特異性

2.1.3 靈敏度：以陽性檢出率為100%的最低稀釋倍數為該方法的靈敏度，檢測結果顯示，該方法檢測CELO標準質粒的靈敏度為102拷貝/μl。見圖2。

圖2 熒光定量PCR方法的靈敏度

2.2 方法的應用

使用熒光定量PCR方法檢測40份雞胚尿囊液和16株流感疫苗主種子批毒種中是否存在CELO污染，結果顯示陽性對照CELO毒種出現S型擴增曲線，40份雞胚尿囊液和16株流感疫苗主種子批毒種擴增曲線均無抬起，判定為CELO陰性。見圖3。

圖3 40份雞胚尿囊液和16株流感疫苗主種子批毒種CELO熒光定量PCR檢測結果

3 討論

目前新建立的CELO熒光定量PCR方法對于檢測雞胚和禽源性生物制品中是否存在外源性CELO病毒污染具有重要意義。新建立的CELO熒光定量PCR檢測方法與傳統的血清學檢測方法相比，建立的熒光定量PCR靈敏度高，最低檢測可達102拷貝/μl，特異性好，與其他種屬的腺病毒及流感病毒間均無交叉反應，檢測時間更短，僅需要1天時間即可完成全部實驗。對于污染了極其微量的外源性CELO病毒時也可以及時檢出，更好的保證雞胚和禽源性生物制品的安全性。

[1]周斌，劉華雷，曹瑞兵.污染疫苗的禽腺病毒分離和鑒定[J].南京農業大學學報，2004，27（3）：78-80.

[2]付瑞，王淑菁，岳秉飛，等.雞胚致死孤兒病毒PCR檢測方法的建立與應用[J].實驗動物科學，2012，29（4）：9-11.

[3]殷震，劉景華.動物病毒學[M].北京：科學出版社，1997.

王淑菁，女，助理研究員，研究方向：實驗動物病毒學。