水中氧含量對脂肪乳氧化穩(wěn)定性的影響

李瑞強(qiáng)，祖元剛，王化，王碩，于欣洋，楊磊，趙修華 （東北林業(yè)大學(xué)生物資源生態(tài)利用國家地方聯(lián)合工程實驗室，黑龍江 哈爾濱150040）

脂肪乳注射液被作為腸外營養(yǎng)的能量來源已經(jīng)有50多年的歷史。它安全性好，對靜脈無刺激，不僅可以為患者快速提供高能量，而且與氨基酸、維生素、電解質(zhì)等治療性輸液還有很好的兼容性，可以配合使用，已經(jīng)成為提高藥物療效的重要制劑研究方向［1］。目前，醫(yī)用脂肪乳通常使用中／長鏈三酰甘油為油相的微乳制劑［2－3］。這些脂肪酸為機(jī)體提供能量和必需脂肪酸，但從另一方面來看，多不飽和脂肪酸易氧化產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化，分解出醛、酮、酸等小分子復(fù)雜化合物，影響乳劑體系的極性平衡和質(zhì)量，出現(xiàn)破乳、漂油等現(xiàn)象，進(jìn)而損害脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA，從而造成組織損傷。從理論上講，脂肪乳劑中多不飽和脂肪酸含量越高，其引發(fā)的脂質(zhì)過氧化程度越重［4］。

雖然目前對于脂肪乳的研究很多，為防止脂肪乳劑的過氧化，通常在配方中適量添加具有抗氧化作用的維生素E［5－7］，包裝都是以封閉性好的玻璃瓶為主。玻璃瓶雖可降低脂肪乳劑在貯存過程中的過氧化問題，但仍未能在提高其穩(wěn)定性方面有較大的突破。

本試驗研究了水中含氧量對脂肪乳體系氧化穩(wěn)定性的影響，對加速氧化條件下，脂肪乳粒徑大小和形貌變化、離心穩(wěn)定性、過氧化值及氧化產(chǎn)物的動態(tài)變化進(jìn)行檢測，對提高脂肪乳穩(wěn)定性的有效途徑進(jìn)行了探討。

1 材料及儀器

長鏈三酰甘油（LCT），中鏈三酰甘油（MCT），鐵嶺北亞藥用油有限公司；卵磷脂S100，上海利寶德生物科技有限公司；維生素E，西安德天藥業(yè)股份有限公司。注射用水1：純化水，制備后儲存3 h以上使用；注射用水2：去離子水，蒸餾后儲存3 h以上使用；注射用水3：去離子水，蒸餾后直接使用。Brookhaven Zeta激光粒度儀（美國）；JEM－1200透射電子顯微鏡（日本電子公司）；3K－30超速離心機(jī)（美國Sigma公司）；UV－2550紫外－可見分光光度計（日本島津公司）。

2 方法

2.1 試驗分組 試驗共分為5組，（1）注射用水1組：脂肪乳水相采用注射用水1；（2）注射用水2組：脂肪乳水相采用注射用水2；（3）注射用水2 ＋維生素E組：脂肪乳水相采用注射用水2，添加0.01%維生素E為抗氧化劑；（4）注射用水3組：脂肪乳水相采用注射用水3；（5）注射用水3＋維生素E組：脂肪乳水相采用注射用水3，添加0.01%維生素E 為抗氧化劑。樣品放入（60±2）℃烘箱中加速氧化60 d，于第0，12，30，60天取樣測定各項指標(biāo)。

2.2 脂肪乳制備方法 預(yù)熱，將卵磷脂、油酸及維生素E加入LCT／MCT（1∶1）混合油中溶解，作為油相；將甘油和泊洛沙姆以加入水中溶解，作為水相。在70 ℃進(jìn)行乳化，調(diào)節(jié)pH 至7.5～8.5，初乳化10 min，800 bar的壓力下勻質(zhì)6循環(huán)，121 ℃滅菌12 min。

2.3 水中氧含量的測定方法 根據(jù)馬樹艷［8］的方法略有改動，Na2S2O3滴定法，淀粉溶液為指示液，滴定至藍(lán)色消失，計算水中氧含量：O2（mol）＝M×V×（1／4）。其中：M—Na2S2O3的濃度；V—消耗Na2S2O3的體積。

2.4 粒徑大小及分布的檢測方法 將100μL脂肪乳用雙純凈水稀釋30倍后加入3 mL 專用樹脂比色皿中，放入激光粒度儀中，在25 ℃測試角90°中測定3次，計算乳劑的平均粒徑。

2.5 脂肪乳形態(tài)觀察 根據(jù)何海冰等［9］的方法，取脂肪乳加純化水稀釋50倍，取適量滴至銅篩網(wǎng)上，用2%鋨酸熏蒸染色，室溫放置至形成薄膜后用透射電子顯微鏡觀察其形態(tài)，同時拍攝照片。

2.6 離心穩(wěn)定性檢測［1］取試樣0.1 mL，稀釋1 000倍，檢測500 nm 波長下的吸光度，記為A0。取試樣1 mL，轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管，4 000 r·min－1離心15 min，20 ℃，取底部液體0.1 mL，檢測500 nm 波長下的吸光度，記為A。離心穩(wěn)定性常數(shù)Ke＝（A0－A）／A0

2.7 脂肪乳過氧化值（PV）測定方法 稱取脂肪乳凍干樣品2.0g，精確至0.001 g，按照中國藥典2010年版二部附錄ⅦH 方法測定。根據(jù)公式PV（meq／kg）＝1 000×C（V1－V0）／m 計算。

2.8 脂肪乳甲氧基苯胺值（AV）測定方法 稱取脂肪乳凍干樣品2.0g，精確至0.001 g，按照中國藥典2010年版二部附錄ⅣA 分光光度計法測定。

2.9 全氧化值的計算方法 全氧化值＝AV＋2×PV。

2.10 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)用±s表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 幾種注射用水中氧的含量 3種注射用水中氧溶解量如圖1所示。注射用水3中溶解的氧氣量僅為（2.24±0.28）μmol／100 mL，為注射用水1和2的十分之一。可以看出：雖然3種注射用水中的氧氣溶解量都是微量的，但新制備的注射用水中氧含量小于經(jīng)過儲存的水中氧含量，且達(dá)到了差異顯著。注射用水1 和2 中氧溶解量沒有顯著差異，2種制備方法對水中氧含量沒有明顯影響。

圖1 3種注射用水中的氧氣溶解量Fig 1 Oxygen content in injection water

3.2 脂肪乳全氧化值的變化 全氧化值是國際上常采用的評價油脂氧化劣變程度的指標(biāo)［10］，即2 倍的過氧化值與p－茴香胺值之和。油脂或磷脂氧化后能夠生成過氧化物和氫過氧化物等產(chǎn)物，這些產(chǎn)物不僅具有一定的毒性，且磷脂氧化后會影響其乳化性能，進(jìn)而影響脂肪乳的穩(wěn)定性，因此對其過氧化值行檢測是保證油脂等安全性和脂肪乳穩(wěn)定性的重要舉措［11］。過氧化物除對動物細(xì)胞中的線粒體及多種酶有強(qiáng)大殺傷作用外，還能繼續(xù)分解成多種有害物質(zhì)，如醛、酮、酸、環(huán)氧化物類［12］，能夠破壞人體細(xì)胞膜的正常生理功能，促使疾病的發(fā)生和發(fā)展，故分解產(chǎn)物的多少，也是衡量注射用油質(zhì)量的重要指標(biāo)，它以測定注射用油的甲氧基苯胺值表示。全氧化值是結(jié)合以上2個指標(biāo)對油脂的氧化程度進(jìn)行評價。各組脂肪乳在加速氧化條件下全氧化值的變化如圖2所示。

圖2 脂肪乳全氧化值隨時間變化結(jié)果t檢驗，與注射用水1比較，aP＜0.05；b P＜0.01Fig 2 Full oxidation value changes with storage days t test，compared with injection water 1，aP＜0.05；b P＜0.01

5 個樣品組的平均初始全氧化值為（7.49±0.31），60 ℃下加速氧化30 d，各試驗組的全氧化值緩慢升高，組間均未達(dá)到差異顯著，表明在短時間內(nèi)不同注射用水對脂肪乳的氧化穩(wěn)定性沒有明顯影響，抗氧化劑的添加對脂肪乳的氧化穩(wěn)定性也沒有明顯影響，30 d內(nèi)乳劑的氧化穩(wěn)定性良好。加速氧化30～60 d，各組脂肪乳的全氧化值迅速升高，最高為注射用水2組，全氧化值（75.2±3.1），注射用水1組為（74.3±3.6），注射用水3組為（69.2±2.9），與注射用水1 和2 組相比，均達(dá)到差異顯著（P＜0.05），表明水中氧氣含量的減少顯著降低了脂肪2乳氧化的程度。添加維生素E 的2 組全氧化值均小于相應(yīng)的未添加抗氧化劑組，表明抗氧化劑的添加抑制了脂肪乳劑的氧化；但2組也存在一定的不同，注射用水2＋維生素E 組的全氧化值僅略小于注射用水2組，兩者未達(dá)到差異顯著；而注射用水3＋維生素E 組的全氧化值為62.53±2.64，小于注射用水3組，兩者差異顯著。結(jié)果表明，在水中氧含量減少的情況下，抗氧化劑的添加顯著提高了脂肪乳抗氧化能力，有效抑制了脂肪乳的氧化率，抑制率為9.63%。

3.3 脂肪乳粒徑的變化 脂肪乳劑屬于熱力學(xué)不穩(wěn)定體系，因而均勻的分散體系是保證制劑物理穩(wěn)定性的基本要求。脂肪乳的物理穩(wěn)定性主要取決于乳滴的粒徑及粒度分布，并且粒徑的大小還影響到藥物在體內(nèi)的分布和代謝［13］。因此，對于其粒徑以及粒度分布的考察，有利于對脂肪乳的氧化穩(wěn)定性進(jìn)行研究。以不同氧含量注射用水制備的脂肪乳粒徑大小及分布變化如圖3所示。

圖3 脂肪乳粒徑大小及強(qiáng)度分布變化圖A.注射用水1第0天；B.注射用水1第60天；C.注射用水2第60天；D.注射用水2＋維生素E第60天；E.注射用水3第60天；F.注射用水3＋維生素E 第60 天；t檢驗，與注射用水1 比較，aP＜0.05，b P＜0.01Fig 3 Particle size and intensity distribution changes with storage daysA.injection water 1，0d；B.injection water 1，60 d；C.injection water 2，60 d；D.injection water 2＋Ve，60 d；E.injection water 3，60 d；F.injection water 3，60 d；t test，compared with injection water 1，aP＜0.05；b P＜0.01

各試驗組的平均粒徑隨加速氧化時間的增加而增大，從最初的200 nm 左右增大到第60 天的750.8 nm（注射用水1組），且粒徑的分布由最初的集中均一狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)椴坏却笮〉?個粒徑主群。第12天時，注射用水1、2、3組間平均粒徑大小差異不顯著，2個添加抗氧化劑組與未添加組達(dá)到了顯著差異。第30天時，注射用水1組與注射用水2、3組間差異顯著，而注射用水2、3組間未見明顯差異，表明在儲存初期水中氧含量的多少未對脂肪乳產(chǎn)生明顯影響，顯著性差異主要來自于水相本身的其他因素。第60天時，注射用水2、3組間達(dá)到差異極顯著（P＜0.01），表明水中氧含量影響了脂肪乳粒徑的變化，氧氣含量的減少降低了脂肪乳粒徑的增大，結(jié)果與全氧化值試驗結(jié)果相符合。

試驗制備的五組脂肪乳初始平均粒徑在204.4～226.5之間，且乳滴大小均勻，分布集中，證明3種注射用水制備的脂肪乳均有良好的初始狀態(tài)，較穩(wěn)定且易于吸收［14］。各組脂肪乳粒徑隨加速氧化時間的增加而增大。第60天，注射用水3＋維生素E組的平均粒徑變?yōu)?45.0nm，小于第30天的294.5 nm，這并不是由于脂肪乳的乳滴變小造成的，而是因為乳劑的狀態(tài)由均一集中逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槠迫椋徊糠至叫〉囊旱谓档土巳閯┝降钠骄担@些小的液滴將逐漸匯聚，不斷增大，不同組脂肪乳形貌觀察如圖4所示。

從電鏡對脂肪乳氧化后的形貌觀察結(jié)果可以看出：第60天時注射用水1組和2組（圖B、C）的脂肪乳已呈現(xiàn)大面積破乳現(xiàn)象，乳滴分散不均勻，邊緣呈不規(guī)則化；注射用水3組（E）乳滴粒徑明顯發(fā)生變化，不再是均勻分布，由于熱加速氧化的作用，乳劑的穩(wěn)定性已經(jīng)被破壞，發(fā)生了團(tuán)聚，粒徑變大，但乳滴的邊緣仍比較規(guī)則；添加抗氧化劑的2 組乳劑（D、F）在相貌上也發(fā)生了一定的變化，注射用水2＋維生素E 組除粒徑發(fā)生變化外呈現(xiàn)出一定的邊緣不規(guī)則狀態(tài)，注射用水3＋維生素E 組僅出現(xiàn)了一定的粒徑變大狀態(tài)，是5組樣品中穩(wěn)定性最好的。形貌研究結(jié)果與粒徑分布檢測結(jié)果說明：注射用水3＋維生素E組在加速氧化結(jié)束時保持了較好的乳劑狀態(tài)，除氧超純水添加抗氧化劑能有效防止乳劑因氧化而導(dǎo)致的穩(wěn)定性降低。

3.4 脂肪乳離心穩(wěn)定性的變化 脂肪乳離心穩(wěn)定性檢測結(jié)果如圖5所示，隨著氧化時間增加，乳劑的離心穩(wěn)定性常數(shù)Ke呈現(xiàn)變大趨勢，表明各組脂肪乳的穩(wěn)定性隨時間的增加而降低。在5 個試驗組中，注射用水3＋維生素E組保持了最好的穩(wěn)定性，30 d時的Ke值為0.60±0.019，與其他各組達(dá)到差異顯著，而其余4組之間未達(dá)到差異顯著。結(jié)果表明：30 d內(nèi)，水中氧含量對脂肪乳的穩(wěn)定性沒有顯著影響，但減少氧含量同時添加抗氧化劑可以有助于提高脂肪乳的穩(wěn)定性。由于60 d時注射用水1組和注射用水2組已發(fā)現(xiàn)明顯的破乳現(xiàn)象，所以未對樣品進(jìn)行離心穩(wěn)定性測定。

圖5 脂肪乳離心穩(wěn)定性隨時間變化結(jié)果Fig 5 Centrifugal stability changes with storage days

通常為防止脂肪乳注射液的氧化，采用充氮保護(hù)、在配方中適量添加抗氧化劑、以玻璃瓶包裝及低溫儲存等方法。這些方法有效的提高了脂肪乳注射液的氧化穩(wěn)定性，而良好的氧化穩(wěn)定性標(biāo)志著優(yōu)質(zhì)的脂肪酸成分和為患者提供能量的安全性。在氮氣保護(hù)下，脂肪乳能夠保持長時間的穩(wěn)定狀態(tài)，從試驗的結(jié)果可以看出，注射用水中氧含量畢竟較少，為2～25μmol／100 mL－1，短時間內(nèi)對脂肪乳氧化穩(wěn)定性的影響較小。但脂肪乳注射液的保質(zhì)期為2年，這是一個長期的過程，這個影響會隨著儲存時間的延長而越來越顯著。在0～30 d過程中，水中氧含量的降低對脂肪乳的氧化穩(wěn)定性，乳滴粒徑和離心穩(wěn)定性的變化并沒有產(chǎn)生顯著性影響，但在30～60 d過程中，乳劑的全氧化值發(fā)生了劇烈變化，由12左右最高增長到75.2，增加了5倍多；同時乳滴的平均粒徑和強(qiáng)度分布結(jié)果也表明脂肪乳的穩(wěn)定性發(fā)生了巨大的變化，此時注射用水3和注射用水3＋維生素E組表現(xiàn)出了與注射用水1組顯著性的差異。試驗結(jié)果表明在長期氧化條件下，去除水中氧能起到增加脂肪乳穩(wěn)定性的作用，而且在減少水中氧含量和添加抗氧化劑的共同作用下，脂肪乳注射液的穩(wěn)定性更好。

4 討論

目前，純油相體系的氧化理論研究較多，抗氧化劑對于純油脂的氧化抑制機(jī)制也研究得較為成熟，但將這些理論用于含油脂的乳狀液體系中時發(fā)現(xiàn)，能有效控制純油脂氧化的各種手段特別是抗氧化劑的抗氧化效果并不理想。本研究的結(jié)果顯示：控制脂肪乳液體系中水相氧含量有助于提高乳劑的氧化穩(wěn)定性，減小脂肪乳粒徑和離心穩(wěn)定性的變化；而且水相體系中氧含量的減少有利于提高抗氧化劑的抗氧化效果，進(jìn)一步降低注射用油脂和磷脂的氧化對脂肪乳帶來的質(zhì)量問題及危害。

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