高效液相色譜法測定鐘祥苦蕎茶中蘆丁的含量

劉娥，郭鵬 （.荊楚理工學院化工與藥學院，湖北 荊門448000；.武漢大學藥學院，湖北 武漢43007）

苦蕎即苦蕎麥，是自然界中甚少的藥食兩用作物。苦蕎擁有獨特、全面、豐富的營養成份，而且藥用特性好，有人體所必須的多種營養成份［1－3］，主要活性物質為黃酮類化合物，具有抗菌消炎、抗氧化、降血脂等多種功效［4－5］。同時，蘆丁是一種天然的抗氧化劑，亦可用于美容化妝品行業。苦蕎茶為苦蕎麥炒制而成。我國苦蕎麥主要分布于云南、四川、寧夏、甘肅等地區［6］。本實驗采用湖北鐘祥彭墩的苦蕎茶，測定其中蘆丁的含量，為保健食品的開發和質量檢測提供參考。

1 材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀（Agilent1100）美國Agilent公司、雙光束紫外可見分光光度計（TU－1901）、電子分析天平（德國賽多利斯CP－224S），Milli－Q 超純水機（美國Millipore公司）。

1.2 試藥 蘆丁對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100080200306）；甲醇（色譜純），水為超純水，其他試劑均為分析純；苦蕎茶（湖北省鐘祥市彭墩生態園，湖北青龍湖農業發 展 有 限 公 司，批 號：20121023、20121028、20121105、20121112、20121123、20121203）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：C18柱（150×4.6 mm，5μm）；流動相：0.2%冰醋酸－甲醇（55∶45），流速：1.0mL·min－1，檢測波長：256 nm，柱溫：30 ℃。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取干燥的蘆丁對照品23.3 mg，置于100 mL量瓶中，用甲醇定容于至刻度，制成0.233 0 g·L－1的蘆丁對照品溶液，精密量取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL蘆丁對照品儲備液，加甲醇稀釋至10 mL 量瓶中，用淋洗液稀釋至刻度備用。

2.3 供試品溶液的制備 取苦蕎茶6.0g，置250 mL 圓底燒瓶中，用100 mL80%乙醇回流提取3次，每次35 min，合并提取液，減壓回收溶劑，濃縮物用甲醇定容于250 mL量瓶中，取2 mL用甲醇定容于25 mL 量瓶中，即得供試品試液。精密量取供試品試液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL，加甲醇稀釋至10 mL量瓶中，用淋洗液稀釋至刻度備用。對照品及樣品的色譜圖如圖1所示。

圖1 高效液相色譜圖a.蘆丁對照品；b.鐘祥苦蕎茶樣品Fig 1 HPLC chromatogramsa.rutin reference substance b.Buckwheat Tea of Zhongxiang

2.4 線性關系考察 精密量取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL蘆丁對照品儲備液，加甲醇稀釋至10 mL 量瓶中，搖勻。分別取以上溶液進樣測定，以峰面積（Y）為縱坐標，以進樣量（X）為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程：Y＝47 088.04 X－7 292.81，r＝0.999 8，結果表明蘆丁在0.233～1.165μg范圍內，線性關系良好。

2.5 精密度試驗 精密量取0.023 3 mg·mL－1蘆丁對照品溶液，同樣色譜條件下，連續進樣5 次，測定其峰面積，RSD為0.95%（n＝5）。

2.6 穩定性試驗 取同一苦蕎茶供試品溶液在相同色譜條件下，于0，2，4，6，8，12 h進樣測定，RSD 為0.99%（n＝6），表明供試品溶液在12 h內穩定。

2.7 重復性試驗 取同一批苦蕎茶，按“2.3”項下方法制備6份供試品溶液，進行測定，RSD 為1.92%（n＝6）。

2.8 加樣回收率試驗 精密吸取蘆丁濃度為0.233 0 mg·mL－1的對照品溶液1，2，3 mL各3份，分別精密加入樣品粉末約0.024 7 g（蘆丁含量為18.9 mg·g－1），按樣品測定方法進行測定，結果蘆丁的平均回收率為99.18%，RSD 為0.89%。

表1 回收率試驗結果Tab 1 Results of recovery rate

2.9 樣品測定 將6種不同批號的苦蕎茶樣品按2.3項下方法制備成供試品溶液，分別進樣。樣品1～6的蘆丁含量依次為1.94%、2.01%、1.89%、1.82%、1.86%、1.77%。

3 討論

3.1 樣品處理方法的選擇 實驗分別考察了提取時間、提取溶劑等因素對苦蕎茶中蘆丁含量的影響，并進行了單因素實驗，結果表明：在80%乙醇，回流時間為每次35 min，提取3次的條件下，蘆丁的含量最高。此方法對樣品處理簡單，快捷。

3.2 流動相的選擇 在試驗中試過乙腈－水、甲醇－水溶液等為流動相，但分離效果不太理想，采用0.2%冰醋酸－甲醇（55∶45）分離效果有明顯改善，峰形較好，故采用0.2%冰醋酸－甲醇（55∶45）為流動相。

本試驗建立了HPLC快速測定苦蕎茶中蘆丁含量的方法，色譜條件：采用0.2%冰醋酸－甲醇（55∶45）為流動相，結果顯示的目標色譜峰分離效果良好、精密度、重復性和回收率的測定均符合要求。本HPLC 法檢測蘆丁方法簡便、快捷、可靠，可用于湖北鐘祥苦蕎麥的質量標準檢測。

［1］ 張以忠，陳慶富.蕎麥的研究現狀與展望［J］.種子，2004，23（3）：39－42.

［2］ 張萬明，譚盛春.苦蕎的營養與食療作用［J］.西昌農業高等專科學校學報，2004，18（2）：16－17.

［3］ 尹禮國，鐘耕.蕎麥營養特性、生理功能和藥用價值研究進展［J］.糧食與油脂，2002，5：32－34.

［4］ 賓婕，劉潔，陳克嶙，等.不同來源苦蕎中蘆丁和槲皮素的含量測定［J］.現代食品科技，2011，27（1）：117－119.

［5］ 黃興富，黎其萬，劉宏程，等.高效液相色譜法同時測定苦蕎中蘆丁、槲皮素和山柰酚的含量［J］.中成藥，2011，33（2）：345－347.

［6］ 曹樹明，李菊，胡煒彥，等.HPLC 法測定苦蕎茶中蘆丁的含量［J］.中國民族民間醫藥雜志，2007，86：173－175.