硝酸益康唑羥丙基－β－環(huán)糊精包合物溫敏緩釋凝膠的制備和特點(diǎn)

馬曉華，蔣曙光，周建平，杜書章，張曉堅(jiān)，闞全程 （.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，河南 鄭州45000；.中國(guó)藥科大學(xué)藥劑學(xué)教研室，江蘇 南京0009）

硝酸益康唑（econazole nitrate，ECN）局部用藥效果顯著，且無(wú)全身不良反應(yīng)。目前其陰道用制劑主要有片劑、膠囊劑、栓劑、凝膠劑、乳劑、洗劑等，但許多制劑存在停留時(shí)間短、藥物滲漏等不足，影響藥效發(fā)揮。通常患者對(duì)凝膠劑較易接受［1］，但傳統(tǒng)凝膠劑給藥不便，不易在陰道黏膜涂布均勻。原位成形凝膠劑由于融合了液體易于流動(dòng)與凝膠制劑易于在給藥部位滯留等優(yōu)點(diǎn)，而成為研究熱點(diǎn)。依據(jù)膠凝機(jī)制不同，凝膠劑主要有溫度敏感型、離子強(qiáng)度敏感型和pH 敏感型，其中在陰道給藥中研究最多的是溫度敏感型原位凝膠。應(yīng)用最多的溫敏凝膠載體為泊洛沙姆，其水溶液具有受熱反向膠凝的性質(zhì)，常用的泊洛沙姆407（p407）膠凝溫度較低，故常與泊洛沙姆188（p188）聯(lián)合使用以提高其膠凝溫度。為增加體系的黏附性，常加入黏附性高分子材料如聚丙烯酸類、殼聚糖、纖維素［2］類等。本實(shí)驗(yàn)以泊洛沙姆為溫敏材料，并加入卡波普提高黏附性，制備了硝酸益康唑羥丙基－β－環(huán)糊精包合物（econazole nitrate HP－β－CD complex，EHC）的溫敏凝膠，并對(duì)制劑體外釋藥及大鼠陰道剌激性進(jìn)行了研究。

1 材料

透皮擴(kuò)散儀（上海精勝科學(xué)儀器有限公司）；Agilent8453紫外掃描儀（美國(guó)Agilent公司）；752C紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海第二儀器制造廠）；DV－ⅢULTRA Brookfield 可 編 程 流 變 儀（American Brookfield）；透析袋（截留相對(duì)分子質(zhì)量7 000 Da，北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司）。

ECN（廣州白云山僑光制藥有限公司）；羥丙基－β－環(huán)糊精（HP－β－CD，西安德立化工有限公司）；硝酸益康 唑HP－β－CD 包 合 物（EHC，自 制）；泊 洛 沙 姆407（p407，BASF公司）；泊洛沙姆188（p188，BASF公司）；卡波普934（cp934，BASF公司）；健康雌性大鼠（中國(guó)藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。

2 方法

2.1 硝酸益康唑含量測(cè)定方法

2.1.1 測(cè)定波長(zhǎng)選擇 精密稱取ECN25 mg于25 mL量瓶中，加無(wú)水乙醇溶解，用pH4.1醋酸緩沖液定容，在200～400 nm 范圍內(nèi)紫外掃描；按比例精密稱取各輔料，加無(wú)水乙醇溶解，醋酸緩沖溶液定容，濾過(guò)，同上法紫外掃描。

2.1.2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密稱取ECN50 mg于50 mL量瓶中，加無(wú)水乙醇溶解，用pH4.1醋酸緩沖液定容，以此為母液分別配制0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 mg·mL－1的溶液。分別測(cè)定其吸光度，得一元線性回歸方程。

2.1.3 精密度試驗(yàn) 精密稱取ECN10，40，70 mg，于100 mL量瓶中，加無(wú)水乙醇溶解，用pH4.1醋酸緩沖溶液定容，在測(cè)定波長(zhǎng)處測(cè)定其吸收度，每日內(nèi)測(cè)定5次，連續(xù)測(cè)定5 d。計(jì)算日內(nèi)和日間精密度。

2.1.4 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取ECN5，20，35 mg，于50 mL量瓶中，按比例加入各輔料，加無(wú)水乙醇，振搖，用pH4.1醋酸緩沖液定容，過(guò)濾，測(cè)定吸收度，計(jì)算回收率。

2.2 溫敏凝膠的制備 按處方質(zhì)量比p407／p188／cp934分別為9／10／0.25、9／17.5／0.1、14.4／15.4／0.23、14.5／10／0.1、14.5／10／0.4、15／15／0.2、15／16／0.2、15.6／13.61／0.23制備，制備方法為：稱取處方量的cp934，于4 ℃純化水中，溶解后，稱取處方量泊洛沙姆，輕微攪拌，4 ℃冷藏至澄清，加入處方量（1%）的EHC，溶解，即得。

2.3 凝膠流變學(xué)研究 在25 ℃，用Brookfield流變儀測(cè)定系列剪切力下的黏度，作出剪切率－剪切應(yīng)力曲線，研究流體性質(zhì)。恒速升高溫度，固定轉(zhuǎn)速測(cè)定黏度。

2.4 膠凝溫度的測(cè)定 采用攪拌子停止法［3］：取適量樣品置西林瓶中，樣品表面加少量硅油以防止水分揮發(fā)，于水浴中，恒速升溫，恒速攪拌，記錄攪拌子停止轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)的溫度即為膠凝溫度。

2.5 體外釋放 采用透析袋法［4］。釋放介質(zhì)為pH4.1醋酸緩沖液100 mL，溫度（37±1）℃，磁力攪拌100 r·min－1。稱取溫敏凝膠5 g，置于透析袋中，透析袋兩端用棉線扎緊，置燒杯中，加釋放介質(zhì)，燒杯密封后置于透皮擴(kuò)散儀，恒速磁力攪拌。分別在系列時(shí)間點(diǎn)取樣3 mL，并迅速補(bǔ)充等量新鮮介質(zhì)，過(guò)濾，測(cè)定吸收度，計(jì)算累積釋放量。

2.6 大鼠陰道剌激性考察 健康雌性大鼠，體質(zhì)量（200±10）g，陰道口消毒后用無(wú)針頭注射器給藥，分別給予生理鹽水（normal saline，NS）、空白溫敏凝膠（blank EMTG）、EHC 溫 敏 凝 膠（EMTG），0.1 mL／只，在受試動(dòng)物作用4 h后，放開動(dòng)物，觀察外觀體征、行為活動(dòng)、進(jìn)食及糞便情況等有無(wú)異常。經(jīng)1 h后處死，取出陰道組織，先肉眼觀察有無(wú)充血、腫脹、水泡及糜爛等現(xiàn)象，然后放入10%甲醛溶液中固定，常規(guī)病理切片，進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

3 結(jié)果

3.1 硝酸益康唑含量測(cè)定 ECN 和輔料在緩沖溶液中的紫外掃描圖譜見(jiàn)圖1所示。由圖可見(jiàn)，ECN在209，231 nm 和271 nm 附 近 有 吸 收 峰，輔 料 在209 nm 和231 nm 處吸收較大，但在271 nm 處無(wú)吸收，因此確定271 nm 為ECN 的測(cè)定波長(zhǎng)。

圖1 硝酸益康唑（a）、輔料（b）的紫外掃描圖譜Fig 1 UV spectrum of（a）ECN and（b）excipients in buffer solution

回歸方程為：A＝0.895 532C＋0.003 905（r＝0.999 9），在0.1～0.8 mg·mL－1范圍內(nèi)線性良好。精密度試驗(yàn)結(jié)果顯示，日內(nèi)精密度小于1%，日間精密度小于1.2%，表明本法穩(wěn)定可靠。平均回收率在99.9%～102.5%，表明本法準(zhǔn)確可靠。

3.2 凝膠流變學(xué) 由圖2（A）可見(jiàn)組成為p407／p188的泊洛沙姆溶液在室溫下，剪切應(yīng)力與剪切率成一條直線，黏度不隨轉(zhuǎn)速改變，近似為牛頓流體。由圖2（B）可見(jiàn)含有卡波普的泊洛沙姆溶液，室溫下，剪切應(yīng)力與剪切率成一條直線，與不含卡波普時(shí)一致，即黏度不隨轉(zhuǎn)速變化，表現(xiàn)為近似牛頓流體。

圖2 p407／p188（A）和p407／p188／cp934（B）的剪切應(yīng)力－剪切率曲線Fig 2 Shear stress to rate curve of p407／p188（A）and p407／p188／cp934（B）

恒速升高溫度，p407／p188：15／15和12／15的黏度曲線如圖3（A）所示。由圖可知，p407、p188水溶液的黏度隨溫度的升高而逐漸升高，表現(xiàn)出溫度敏感性。含有卡波普的泊洛沙姆溶液的黏度曲線如圖3（B）所示。由圖可知，隨溫度的升高，黏度逐漸增大，表現(xiàn)出溫度敏感性，說(shuō)明cp934的加入不影響泊洛沙姆溶液的溫度敏感特性。

圖3 p407／p188（A）和p407／p188／cp934（B）在不同溫度下的黏度Fig 3 Viscosity of p407／p188（A）and p407／p188／cp934（B）in different temperature

3.3 膠凝溫度 含有0.1，0.2，0.4及不含cp934的p407／p188為12／15、15／15 的水溶液，測(cè)得的膠凝溫度如圖4（A）所示。由圖可見(jiàn)，cp934的存在使泊洛沙姆水溶液的膠凝溫度降低，且隨cp934含量的增加，降低更加明顯。

HP－β－CD 和EHC 含 量 為0%～2%，p407／p188為15／10 的水溶液膠凝溫度測(cè)定結(jié)果如圖4（B）所示。可見(jiàn)HP－β－CD（H）和EHC 對(duì)泊洛沙姆水溶液有所影響，均使膠凝稍有升高。

含有EHC的泊洛沙姆溶液膠凝溫度測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1，表明其膠凝溫度在33～37 ℃。

3.4 體外釋放 處方為p407／p188／cp934／EHC為14.4／15.4／0.23／1的溫敏凝膠，分別以pH4.1，4.4，5.0，5.3的醋酸鹽緩溶液為釋放介質(zhì)，進(jìn)行釋放度研究，以累積釋放度對(duì)時(shí)間作圖如圖5（A），由圖可見(jiàn)隨著pH 值的升高藥物釋放速度明顯放緩。

以pH4.1的醋酸鹽緩溶液為釋放介質(zhì)，對(duì)一組不同配比的處方進(jìn)行釋放度研究，以累積釋放度對(duì)時(shí)間作圖如圖5（B），由圖可見(jiàn)，4種配比的處方，釋藥曲線基本一致，并沒(méi)有顯著性差異。

圖4 卡波普（A）和（B）對(duì)膠凝溫度的影響Fig 4 TS－Gof poloxamer containing carbopol（A），H or EHC（B）

表1 含主藥凝膠的膠凝溫度Tab 1 The TS－Gof poloxamer containing EHC

圖5 在不同pH（A）和pH4.1（B）的釋放介質(zhì)中的釋放曲線Fig 5 Release curve in dissolution media with different pH （A）and pH4.1（B）

分別以零級(jí)、一級(jí)、Higuchi模型、Peppas模型及Weibull模型，將在各時(shí)間點(diǎn)的累積釋藥百分率對(duì)時(shí)間（t）進(jìn)行回歸，得回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表2。由表可見(jiàn)，在幾種模型中，以Peppas模型和Weibull模型的擬合度最高。

表2 釋放模型Tab 2 Regression equation

3.5 大鼠陰道剌激性考察 大鼠陰道給藥，作用4 h后，觀察大鼠外觀體征、行為活動(dòng)、進(jìn)食及糞便等均正常。大鼠陰道黏膜常規(guī)組織病理切片，如圖6所示。A 為給予生理鹽水、B為空白溫敏凝膠、C 為EHC溫敏凝膠后的，可以看到，3 組大鼠陰道黏膜上皮結(jié)構(gòu)完整，并無(wú)增生或萎縮等變化。黏膜下血管無(wú)充血，無(wú)擴(kuò)張，無(wú)炎性滲出物。說(shuō)明所制備的EHC溫敏凝膠對(duì)大鼠陰道黏膜無(wú)剌激性。

圖6 大鼠陰道黏膜常規(guī)組織病理切片（a為給予生理鹽水、b為空白溫敏凝膠、c為EHC溫敏凝膠）Fig6 Morphology of vaginal tissues after single application of（a）N S，（b）blank EMTG（×100），（c）EMTG（×200）

4 討論

4.1 包合物 硝酸益康唑是咪唑類廣譜抗真菌藥物，臨床上主要用于念珠菌陰道炎、股癬、手足癬、花斑癬等。由于ECN 親脂性強(qiáng)，極微溶于水，難以直接用于研制外觀透明、室溫下物理穩(wěn)定的溫度敏感型原位凝膠，同時(shí)也難以實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物釋放速度的有效控制。因此前期采用環(huán)糊精包合技術(shù)，制備了ECN 的HP－β－CD 包 合 物，在 本 研 究 中 進(jìn) 一 步 制 備了包合物的陰道用溫敏緩釋凝膠。

4.2 流變學(xué) 室溫下，泊洛沙姆溶液的剪切應(yīng)力與剪切率成直線關(guān)系，表現(xiàn)近似為牛頓流體，溶液的黏度隨溫度的升高而增大表現(xiàn)出溫度敏感性，卡波普的加入不影響泊洛沙姆的流體性質(zhì)和溫敏性。卡波普的存在使膠凝 溫度稍 有降低，而HP－β－CD 和EHC均使膠凝稍有升高，這是因?yàn)榭úㄆ帐谷芤旱酿ざ仍龃螅笳邉t使黏度有所降低。卡波普本身具有pH 敏感性，但為使陰道維持在正常的pH 值，在本研究中僅利用其增加黏附性。

健康婦女陰道溫度為37.2℃，溫敏凝膠基質(zhì)在此溫度下應(yīng)能形成半固體的凝膠，而在室溫下，為了給藥方便，應(yīng)為可自由流動(dòng)的液體。本實(shí)驗(yàn)中制備了幾種配比的p407／p188／cp934 EHC溫敏凝膠，膠凝溫度在33～37 ℃之間。膠凝溫度的測(cè)定采用攪拌子停止法簡(jiǎn)單實(shí)用，但需要預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索出合適大小的攪拌子和恰當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)速，并需在所有樣品的測(cè)定過(guò)程中固定不變。

4.3 體外釋放 陰道上皮細(xì)胞內(nèi)富有糖元，糖元分泌后經(jīng)乳酸桿菌分解成乳酸，使陰道pH 維持在3.8～4.2［5］，而疾病等因素會(huì)使陰道pH 值稍有升高。實(shí)驗(yàn)中研究了制劑在不同pH 釋放介質(zhì)中的體外釋放，結(jié)果發(fā)現(xiàn)介質(zhì)的pH 值對(duì)藥物的釋放速度有顯著的影響。隨著pH 值的升高藥物釋放速度明顯放緩，這可能是由于隨pH 值的升高卡波普的黏度顯著增大所致。在pH4.1 的釋放介質(zhì)中，各處方均可持續(xù)緩慢釋放藥物達(dá)48 h，顯示出優(yōu)良的緩釋效果。這為減少給藥次數(shù)，甚至“一劑即愈”提供了可能。

從釋放模型的擬合來(lái)看，Peppas 模型和Weibull模型的擬合度最高，Peppas模型認(rèn)為當(dāng)指數(shù)n＜0.5時(shí)，藥物釋放機(jī)制符合Fickian 擴(kuò)散；當(dāng)0.5＜n＜1時(shí)，藥物釋放為非Fickian擴(kuò)散［6］。本實(shí)驗(yàn)中擬合的Peppas曲線n＝0.416 3，說(shuō)明藥物釋放機(jī)制為濃度依賴的Fickian擴(kuò)散。

Weibull分布模型由于能很好地?cái)M合藥物釋放的全過(guò)程，而且能用于各種劑型，因此應(yīng)用廣泛［7］，但Weibull模型中各參數(shù)的意義尚無(wú)定論，Mughal等［8］研究認(rèn)為，模型中參數(shù)b與Peppas模型中參數(shù)n線性相關(guān)，并且推斷，b≤0.75說(shuō)明釋藥機(jī)制為Fickian擴(kuò)散；0.75＜b＜1時(shí)說(shuō)明釋藥機(jī)制為Fickian擴(kuò)散和Ⅱ型轉(zhuǎn)運(yùn)。本實(shí)驗(yàn)中擬合的Weibull模型b＝0.629 3，說(shuō)明釋藥機(jī)制為Fickian 擴(kuò)散，與Peppas模型的結(jié)論一致。

4.4 剌激性 研制的溫敏凝膠對(duì)大鼠陰道黏膜無(wú)剌激性，這與泊洛沙姆、卡波普及羥丙基環(huán)糊精良好的生物相容性有關(guān)。

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