李歐，劉祖雄，胡戴，符旭東 （.廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院藥劑科，湖北 武漢430070；.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢

430065）

牙周炎是侵犯牙齦和牙周支持組織的慢性炎癥性破壞性疾病，是導(dǎo)致成年人牙齒喪失的主要原因［1］。隨著病情的發(fā)展，牙周組織破壞程度日益嚴(yán)重，牙周袋變深，存在于牙齦組織或牙體組織內(nèi)的致病菌很難徹底清除［2］，單純的機(jī)械治療很難達(dá)到滿(mǎn)意的效果，因此需結(jié)合藥物進(jìn)行局部治療。理想的口腔局部給藥系統(tǒng)應(yīng)含有藥物貯庫(kù)，并且有利于藥物在牙周袋內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間維持有效的抑菌或殺菌濃度。鹽酸多西環(huán)素（DXY）是半合成四環(huán)素類(lèi)廣譜抑菌劑，能有效控制牙周的齦下菌斑，抑制牙周病致病菌。殼聚糖是現(xiàn)今所發(fā)現(xiàn)的唯一具有明顯堿性、帶有正電荷的天然多糖，具有良好的生物黏附性和組織相容性。作為載體材料的殼聚糖除具有控釋和生物黏附作用外，還具有殺菌、消炎、維持體內(nèi)生態(tài)平衡、促進(jìn)傷口愈合和促進(jìn)骨形成的作用［3］。羧甲基殼聚糖（CMCTS）是殼聚糖衍生物，除具備殼聚糖的特性外還具備良好的水溶性，作為輔料具有更好的適用性。筆者以DXY 為模型藥物，CMCTS 為載體，采用乳化－交聯(lián)固化法制備鹽酸多西環(huán)素羧甲基殼聚糖微球，以載藥量、包封率、收率為指標(biāo)，通過(guò)星點(diǎn)設(shè)計(jì)篩選最優(yōu)處方，研制了緩釋時(shí)間更長(zhǎng)、可以通過(guò)牙周袋植入方式給藥的DXY 微球，并研究了微球的體外釋放性能，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料

UV－2550紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津儀器有限公司）；CHA 雙目光學(xué)顯微鏡（日本olympus）；FEI Quanta 200掃描電鏡（荷蘭FEI公司）；JEOL JFC－1600 AUTO FINE COATER 離子濺射儀（日本電子株式會(huì)社）；BS223S電子天平（北京賽多科斯儀器系統(tǒng)有限公司）。DXY（湖北恒碩化工有限公司，含量：99.0%）；羧甲基殼聚糖（脫乙酰度＞90%，北京華邁科生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；液體石蠟；司盤(pán)－80，甲醛等其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 鹽酸多西環(huán)素羧甲基殼聚糖微球的制備 室溫下將3%CMCTS生理鹽水溶液4 mL 緩慢滴入含2%司 盤(pán)－80 的 液 體 石 蠟30 mL 中，以500 r·min－1的速度機(jī)械電動(dòng)攪拌20 min，使之成為穩(wěn)定的乳化體系，加入1 mL甲醛交聯(lián)固化3 h，靜置，傾棄上層油層，加入適量石油醚，4 000 r·min－1離心10 min，所得沉淀分別用0.2%亞硫酸氫鈉溶液洗滌、無(wú)水乙醇脫水3次，置于40 ℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中干燥24 h，即得空白CMCTS微球。

將30 mg DXY 均 勻 分 散 在3% CMCTS 生 理鹽水溶液4 mL中，緩慢滴入含2%司盤(pán)－80的液體石蠟30 mL 中，隨后制備方法同空白微球，即得到DXY－CMCTS微球。

2.2 DXY－CMC微球相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定

2.2.1 形態(tài)及粒徑 取微球少許置于載玻片上，用帶測(cè)微尺的光學(xué)顯微鏡觀察其形態(tài)，為大小不一，圓整度較好的金黃色球體，見(jiàn)圖1。選擇有代表性的區(qū)域，測(cè)定不少于200個(gè)粒子，并將粒徑范圍劃分為若干個(gè)單元，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理求得平均粒徑為（25±8）μm。粒徑的分散度用跨距4表示，計(jì)算公式為：跨距＝（D90－D10）／D50，式中D90、D50、D10分別指有90%，50%，10%的粒子數(shù)小于該值的粒徑，經(jīng)計(jì)算得跨距為0.86。SEM 下見(jiàn)微球表面光滑圓整，為規(guī)則球形，見(jiàn)圖2。

圖1 光學(xué)顯微鏡下DXY－CMCTS－MS的照片（×400）Fig 1 The picture of DXY－CMC through light microscope（×400）

圖2 DXY 微球掃描電鏡照片（×3 000）Fig 2 Scanning electron microscopes of doxycycline hydrochloride microspheres（×3 000）

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密稱(chēng)取DXY 對(duì)照品20 mg，置于100 mL量瓶中，加0.1 mol·L－1鹽酸溶液溶解并定容，即得到0.2 g·L－1的DXY 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。取儲(chǔ)備液加0.1 mol·L－1鹽酸溶液配成20μg·mL－1的溶液，紫外掃譜，在268 nm 處有最大吸收。取空白微球適量，充分研磨，加0.1 mol·L－1鹽酸溶液定容至25 mL，超 聲2 h，微 球 完 全 消 解 后，4 000 r·min－1離心10 min，取上清液2 mL 用0.1 mol·L－1鹽酸溶液稀釋定容于10 mL 量瓶中，紫外掃譜，在268 nm 處沒(méi)有吸收峰，輔料對(duì)DXY 測(cè)量沒(méi)有干擾。取DXY 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制4，8，12，16，24，28，32，36 μg·mL－1的系列DXY 溶液，以0.1 mol·L－1鹽酸溶液為空白，在268 nm 處測(cè)定吸光度Y。以質(zhì)量濃度X 為橫坐標(biāo)，Y 為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y＝0.028 3 X－0.005 1（r2＝0.999 8）。

同法測(cè)得DXY 在PBS（pH7.4）中278 nm 處有最大吸收，且輔料278 nm 處對(duì)DXY 測(cè)定無(wú)干擾，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y＝0.029 6 X＋0.000 4（r2＝0.999 6）。

結(jié)果表明，2 種溶劑中鹽酸多西環(huán)素在4～36 μg·mL－1范圍內(nèi)，吸光度Y 與濃度X 具有良好的線性關(guān)系。

2.2.3 精密度的測(cè)定 在線性范圍內(nèi)配制高、中、低3種質(zhì)量濃度（5，15，25μg·mL－1）的DXY 標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)質(zhì)量濃度于一日內(nèi)每隔2 h在268 nm 處測(cè)定吸光度A，連續(xù)測(cè)定5次，考察測(cè)定方法的日內(nèi)精密度，同法測(cè)定日間精密度，每個(gè)質(zhì)量濃度連續(xù)測(cè)定5 d。測(cè)得日內(nèi)精密度的RSD%分別為0.07%，0.11%，0.12%。日 間 精 密 度 分 別 為0.58%，0.48%，0.45%。

2.2.4 回收率測(cè)定 稱(chēng)取適量CMCTS空白微球用0.1 mol·L－1鹽酸溶液溶解，向此溶液中精密加入不同量的DXY 原料藥，配制成低、中、高3 種質(zhì)量濃度（5，15，25μg·mL－1）的DXY 溶液，完全溶解后，以0.1 mol·L－1鹽酸溶液為空白對(duì)照，于268 nm處分別測(cè)定吸光度A。各測(cè)定3次。根據(jù)“2.2.2”項(xiàng)下的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算檢出量，求算平均方法回收率分別為98.3%，96.8%，97.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.7%，3.2%，3.0%。

2.2.5 載藥量與包封率 取微球適量，充分研磨，精密稱(chēng)量25 mg，加0.1 mol·L－1鹽酸溶液定容至25 mL，超聲2 h，微球完全消解后4 000 r·min－1離心10 min，取上清液2 mL用0.1 mol·L－1鹽酸溶液稀釋定容于10 mL 量瓶中，在268 nm 處測(cè)定吸光度Y 值，計(jì)算微球載藥量和包封率，計(jì)算公式為：

載藥量＝（微球中DXY 的質(zhì)量／稱(chēng)取的微球質(zhì)量）×100%

包封率＝（實(shí)際含藥量／理論含藥量）×100%2.2.6 收率的測(cè)定 將最后得到的微球產(chǎn)品用電子天平精密稱(chēng)重，計(jì)算。

收率＝（制得載藥微球總量／投入固體的總質(zhì)量）×100%

2.3 星點(diǎn)設(shè)計(jì)法優(yōu)化處方

2.3.1 優(yōu)化處方設(shè)計(jì) 在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取對(duì)微球性質(zhì)影響較大的3個(gè)因素作為考察對(duì)象，分別為因素X1：投藥比，即CMCTS和DXY 的質(zhì)量百分比（WCMCTS／WDXY，%）；因素X2：油水相的體積百分比（Voil／Vwater，%）；因 素X3：交 聯(lián) 劑 甲 醛 用 量（mL）。采用三因素五水平的星點(diǎn)設(shè)計(jì)對(duì)處方進(jìn)行優(yōu)化，該設(shè)計(jì)由2個(gè)析因設(shè)計(jì)點(diǎn)（±1），2個(gè)極值點(diǎn)（±α）和一個(gè)中心點(diǎn)構(gòu)成。各因素的極大、極小值根據(jù)單因素考察的結(jié)果和制備的實(shí)際需要而定。將指標(biāo)效應(yīng)，即載藥量（Y1）、包封率（Y2）和收率（Y3）與因素進(jìn)行模型擬合，并根據(jù)所建立的數(shù)學(xué)模型描繪三維效應(yīng)面，從效應(yīng)面的較優(yōu)區(qū)域可直接讀取較佳的工藝條件。因素和水平見(jiàn)表1；試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2，其中試驗(yàn)號(hào)15～20為星點(diǎn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)設(shè)計(jì)，重復(fù)試驗(yàn)后取平均值5－8。

表1 星點(diǎn)設(shè)計(jì)因素水平表Tab 1 Factors and levels in the central composite design

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab 2 Experimental design and results

2.3.2 模型擬合和預(yù)測(cè) 根據(jù)上述結(jié)果分別將各因素（自變量）各水平對(duì)評(píng)價(jià)指標(biāo)（因變量）進(jìn)行多元線性回歸（Y＝b0＋blX1＋b2X2＋b3X3）和二次多項(xiàng)式回歸擬合（Y＝b0＋blX1＋b2X2＋b3X3＋b4＋b5＋b6＋b7X1X2＋b8X1X3＋b9X2X3）。通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果如下：

多元線性回歸方程：

二次多項(xiàng)式回歸方程：

從擬合結(jié)果可見(jiàn)：3個(gè)指標(biāo)采用二次多項(xiàng)式方程擬合的相關(guān)系數(shù)均比多元線性回歸方程高。故以二次多項(xiàng)式方程為數(shù)學(xué)模型，應(yīng)用Design－Expert.V8軟件，描繪三維效應(yīng)面圖，見(jiàn)圖3。

圖3 投藥比、油水比和交聯(lián)劑用量對(duì)載藥量、包封率、收率的效應(yīng)曲線圖A.投藥比（X1），交聯(lián)劑用量（X3）對(duì)載藥量（Y1）的三維效應(yīng)面圖；B.投藥比（X1），油水比（X2）對(duì)包封率（Y2）的三維效應(yīng)面圖；C.交聯(lián)劑用量（X3），油水比（X2）對(duì)收率（Y3）的三維效應(yīng)面圖Fig 3 Predicted 3D response surface of the dosage ratio，the ratio of oil to water and the amount of cross－linking agents on drug loading，encapsulation efficiency and yield

2.3.3 優(yōu)化處方的預(yù)測(cè)及驗(yàn)證 利用各效應(yīng)面的等高線疊加圖進(jìn)行優(yōu)化制備工藝的分析，得到理想的優(yōu)化區(qū)域，從優(yōu)化區(qū)域中選定最佳優(yōu)化的制備水平，即投藥比WCMCTS／WDXY＝2.42、油水比Voil／Vwate＝7.97、交聯(lián)劑甲醛用量為0.71 mL。根據(jù)優(yōu)化的處方制備3批DXY－CMCTS微球，并測(cè)定相關(guān)指標(biāo)參數(shù)，計(jì)算平均值。結(jié)果顯示，實(shí)測(cè)值和預(yù)測(cè)值非常接近，采用效應(yīng)面法優(yōu)化的DXY－CMCTS－MS處方達(dá)到了預(yù)期的效果。最佳處方的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值見(jiàn)表3。

2.4 體外釋藥性能考 采用動(dòng)態(tài)膜透析法［9］測(cè)定DXY 原 料 藥 及DXY－CMCST－MS 體 外 釋 放 特 性。精 密 稱(chēng) 取DXY原 料 藥 和DXY－CMCTS－MS適 量（約含DXY5 mg）置于透析袋中，加pH 7.4［10］的PBS溶液（含0.02%疊氮鈉作為抑菌劑［11］）2 mL，封口，置于裝有50 mL上述釋放介質(zhì)的具塞三角瓶中，在（37±0.5）℃空氣恒溫振動(dòng)器中以100 r·min－1速度振蕩，每隔一定時(shí)間取樣1.0mL，立即補(bǔ)加等量同質(zhì)同溫釋放介質(zhì)1.0 mL。將所取樣1.0 mL稀釋至5.0 mL，測(cè)定其278 nm 處紫外吸光度值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算藥物濃度，計(jì)算藥物累計(jì)釋放量及累積釋放百分比。繪制累積釋放曲線，見(jiàn)圖4。

表3 最佳處方的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值（n＝3）Tab3 Predicted and observed value of the optimized formulation（n＝3）

圖4 DXY 原料藥和微球的體外釋放曲線（n＝3）Fig 4 In vitro accumulative release curve of raw medicine（DXY）and DXY－CMC－MS（n＝3）

由累積釋放度曲線可看出，DXY 原料藥在1.3 h內(nèi)釋放率達(dá)99%，基本釋放完全，可見(jiàn)透析袋的阻滯作用影響較小，而DXY－CMCTS－MS 僅釋放了51%，與原料藥相比，微球?qū)λ幬锞哂忻黠@的緩釋作用。微球的釋藥有兩個(gè)明顯的階段，前期釋放較快，在前30 min內(nèi)釋放量為24.1%，符合中國(guó)藥典規(guī)定的要求（低于40%），后期釋藥則趨于平穩(wěn)。將DXY 微球釋放的時(shí)間與累計(jì)釋放度分別用零級(jí)模型、一級(jí)模型、威布爾（Weibull）函數(shù)和Higuchi模型進(jìn)行擬合［10］。體外釋放的模擬擬合情況，見(jiàn)表4。

表4 DXY 微球在PBS（pH7.4）溶液中釋放的模型擬合情況Tab 4 The in vitro release of the model fitting solution of DXY－MS in PBS（pH7.4）

由體外釋放的模型擬合情況可以看出，以各方程的相關(guān)系數(shù)為指標(biāo)，得微球在PBS（pH7.4）溶液中釋放更符合Weibull方程，有一定的緩釋作用。

3 討論

羧甲基殼聚糖可被甲醛等交聯(lián)劑通過(guò)氨醛縮合反應(yīng)形成的鍵橋固化而形成微球，并將藥物固定于微球骨架之中或結(jié)合于微球表面［12］。

制備工藝中CMCTS與DXY 的比值對(duì)微球的載藥量與包封率的影響體現(xiàn)在CMCTS與DXY 的比值越小，即DXY 的比例越大，載藥量越大，而受羧甲基殼聚糖微球包載藥物的能力的限制，在一定范圍內(nèi)，包封率則會(huì)呈下降趨勢(shì)。采用乳化交聯(lián)法制微球，交聯(lián)劑的選擇和用量對(duì)微球的制備至關(guān)重要，不同的交聯(lián)劑其交聯(lián)能力亦不相同，在預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)選用了戊二醛和甲醛作為交聯(lián)劑，戊二醛的交聯(lián)能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于甲醛，但是戊二醛交聯(lián)所制備的微球不容易降解，且突釋現(xiàn)象較為嚴(yán)重，因而選用甲醛作為交聯(lián)劑，通過(guò)星點(diǎn)設(shè)計(jì)處方優(yōu)化可以看出甲醛用量對(duì)微球形態(tài)，載藥量和包封率的影響，即交聯(lián)劑使用過(guò)少，微球交聯(lián)不完全，微球的成球性較差，隨著交聯(lián)劑用量的增加，微球顏色加深，外觀趨于圓滑，但是載藥量和包封率會(huì)減小，這是由于較多的交聯(lián)劑使微球致密，其內(nèi)部空隙減少，所包裹的藥物就會(huì)相應(yīng)降低。當(dāng)交聯(lián)劑用量繼續(xù)增加時(shí)，微球之間也會(huì)發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)而互相黏著，使球形變差。

本實(shí)驗(yàn)采用動(dòng)態(tài)膜透析法進(jìn)行體外釋放度測(cè)定。微球中藥物的釋放速率與藥物在釋放介質(zhì)中的溶解度、藥物在微球體中所處的物理狀態(tài)、藥物與微球的親和力等因素有關(guān)。初期釋放的為吸附在微球表面的藥物，釋藥速率較快，而隨后的緩慢釋放則是由于釋放介質(zhì)通過(guò)微球表面的微孔滲入微球內(nèi)部，CMCTS吸水后溶脹，使微球的微孔口徑縮小，加上微球骨架與釋放介質(zhì)的作用，致使藥物釋放緩慢。

采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)的方法優(yōu)化微球處方，通過(guò)效應(yīng)面來(lái)表達(dá)考察指標(biāo)和考察因素之間的關(guān)系，對(duì)實(shí)驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式擬合，同時(shí)對(duì)建立的數(shù)學(xué)模型的預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值比較接近，說(shuō)明星點(diǎn)設(shè)計(jì)優(yōu)化所建立的數(shù)學(xué)模型具有很好的預(yù)測(cè)性，且制備的DXY－CMC－MS的形態(tài)圓整，具有較高的載藥量，緩釋作用良好，工藝操作易于控制。

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