核磁共振氫譜研究二氫楊梅素的抗氧化機理

鄭秋闿，范晶晶，陳鳴才，許 凱

（1.濰坊學院化學化工與環境工程學院，山東濰坊 261061；2.濰坊學院生物與農業工程學院，山東濰坊 261061；3.中國科學院廣州化學研究所，廣東廣州 510650）

二氫楊梅素（DMY）屬于黃酮類化合物，大量存在于葡萄科蛇葡萄屬植物中，具有消炎抑菌［1］、抗高血壓［2－3］、保護肝臟［4－6］等作用，可以作為天然抗氧劑應用于油脂及高油食品的保藏［7－8］。在本實驗室的前期工作中，首次將DMY 應用于高分子材料中，發現DMY對各種高分子材料的抗氧化作用均優于合成抗氧劑［9－10］。本文對DMY 的抗氧化機理進行初步研究，確定了DMY 分子中發揮抗氧化作用的主要基團。本文將引發劑（過硫酸銨）作為自由基的供體，與DMY混合，研究DMY 分子上羥基的變化。本研究不僅為DMY 在高分子材料中的應用提供基本數據，而且有助于進一步揭示DMY 在生物體內的抗氧化作用機理，為其在醫療、食品等方面的應用提供理論指導。

1 實驗

1.1 原材料及實驗儀器

材料：DMY 粗提物，廣州大學化學與化工學院；三油酸甘油酯，分析純，天津津沽工商實業公司；其他各種化學試劑均為瓶裝分析純試劑，市售品。

儀器：超導核磁共振譜儀，DRX－400 型，德國BRUKER 公司。

1.2 DMY樣品的制備及其純度檢測

DMY 粗提物加入3 倍質量的丙酮，加熱回流提取30min；將回流液過濾，加入3倍體積的沸水，靜置2h，置于4 ℃的冰箱中24h，使其析出針狀結晶；重復沸水溶解以及結晶的過程5次，純化得白色針狀結晶。

制得的DMY 經高效液相色譜檢測其純度。色譜條件：色譜柱為Prep Nova－Pak HR C18色譜柱（3.9 mm×300mm）；流動相由乙腈、水、乙酸按1∶9∶0.1的比例制成，速率為1.0mL／min；檢測波長288nm；進樣量為20 μL。用面積歸一法算得其純度為99.77%。

1.3 測試方法

物質的量之比為1∶2的過硫酸銨和DMY 溶于氘代二甲亞砜，80 ℃油浴加熱，分別對空白的DMY樣品，加熱前、加熱1h、加熱2h的過硫酸銨和DMY的混合樣品進行核磁共振氫譜分析。

2 結果與討論

DMY分子包含15個碳原子，6個羥基，構成C6－C3－C6的三環結構（見圖1）。為了確定DMY 在抗氧化過程中起作用的基團，將引發劑（過硫酸銨）作為自由基的供體與DMY 混合，研究DMY 上羥基的變化。過硫酸銨的自由基產生的半衰期隨溫度的升高而縮短，100℃下為0.17h，80℃下為2.1h，60℃下為38.5h。

圖1 DMY化學結構

物質的量之比為1∶2的過硫酸銨和DMY 溶于氘代二甲亞砜，加熱前后的空白DMY 樣品、過硫酸銨和DMY 的混合樣品進行核磁共振氫譜分析，所得圖譜見圖2。圖2中的δ 為化學位移，空白樣品編號為（a），過硫酸銨與DMY 混合但未加熱樣品編號為（b），混合后加熱1h樣品編號為（c），混合后加熱2h樣品編號為（d）。

圖2 核磁共振氫譜

DMY 的核磁共振氫譜羥基峰化學位移δ：δ＝8.23ppm 為4′—OH；δ＝8.93ppm 為3′—OH 和5′—OH；δ＝10.83ppm 為7—OH；δ＝11.88ppm 為5—OH。δ＝4.39ppm 雙峰為C 環上2—H，屬于比較穩定的結構，在整個清除自由基的過程中不參與反應。將各羥基峰面積Ax與δ＝4.39ppm 的峰面積A4.39相比，就能得到各羥基的相對含量（見圖3）。

圖3 核磁共振氫譜相對峰面積

由圖3可以看到，加熱前添加過硫酸銨的DMY 的羥基沒有任何變化，但加熱1h以后，5—OH 和7—OH的含量稍有降低，3′—OH 和5′—OH 的含量降低了一半，4′—OH 已經全部反應；加熱2h以后，5－OH 和7—OH 的含量又稍有降低，3′—OH 和5′—OH 已經全部反應。可以推斷，DMY 分子中各個位置羥基的反應活性如下：4′—OH 反應活性大于3′—OH 和5′—OH 的反應活性大于5—OH 和7—OH 的反應活性。

這種在具有抗氧化活性的物質中添加自由基生成劑，通過檢測老化過程中抗氧化物質結構的變化，判斷活性點位和抗氧化機理的方法適用于多種物質，具有通用性。

存在于植物中大多數的黃酮類化合物都具有抗氧化性，這與黃酮類物質特殊的化學結構有關，即構效關系［11］。許多實驗都表明黃酮類抗氧化劑的活性與酚羥基的數目無關，但與分子中是否存在鄰二酚羥基有關［12－13］，黃酮抗氧化劑的B環上取代基的特性對其抗氧化性有很大的影響。B環的酚羥基是活性中心，而A 環酚羥基清除自由基作用很弱［14］，原因是B環羥基處于鄰位，可通過形成分子內氫鍵和共振作用兩種機制使苯氧自由基趨于穩定［15－16］（見圖4），而A 環羥基處于間位，不具備上述穩定機制，所以活性較差。DMY 分子中具有鄰苯三酚型酚羥基結構，被抽氫后可形成2個分子內氫鍵，更穩定，所以其活性比鄰二酚羥基更高。但如果酚羥基在形成苯氧自由基之前即與鄰近的雜原子形成分子內氫鍵，則其抽氫反應還要克服氫鍵鍵能，這將使其活性降低［9］。大多數黃酮化合物中A 環羥基與C環的氧原子處于間位，因此A 環羥基活性總是很低，這是B環羥基成為黃酮抗氧化活性中心的又一原因。DMY分子中B環3′，4′，5′—OH 為3個相鄰的羥基，在清除自由基的過程中，在電子離域作用下可形成更加穩定的自由基，同時可以作為鰲合金屬離子的接合點［17］，相較B環上只有1個羥基的黃酮，抗氧化活性更強。另外，C環中3—OH，A 環中5—，7—OH 的存在同樣增強了DMY清除自由基的能力。

圖4 黃酮中B環穩定機理

3 結論

將DMY 與引發劑混合加熱，DMY 分子上羥基的變化表明B環的3個相鄰的羥基是活性中心，其特殊結構對其抗氧化性有很大的影響。

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