鴨脂聯素基因的單核苷酸多態性研究分析

張引紅 李慧芳 朱文奇

（1.山西醫科大學實驗動物中心，太原 030001；2. 中國農業科學院家禽研究所，揚州 225003）

脂聯素（Adiponecyin）是20世紀90年代中期發現的一種脂肪細胞分泌的激素蛋白，并且是迄今為止所發現的唯一與肥胖呈負相關的脂肪細胞因子。脂聯素在不同的組織中與不同的受體結合，發揮其特定的生物學功能［1］，如調節能量代謝，抵抗炎癥，緩解子宮發育遲緩等功能。脂聯素又被稱作Axrp30、apM1、AdipoQ和GBP28，屬于膠原樣血漿蛋白，是脂肪組織高度表達分泌的一種活性物質，其能夠影響機體處理糖類和脂肪的能力。最早是由Scherer等［2］從小鼠脂肪組織中發現的，其后陸續從人［3］、豬［4］、雞［5］、鴨和牛［6］等中獲得了脂聯素基因，并克隆了該基因的序列。人和哺乳動物脂聯素基因包括3個外顯子和2個內含子［7］，而禽類由2個外顯子和1個內含子組成［5］。人的脂聯素基因位于3q27、小鼠位于16號、雞位于9號染色體上，分別編碼244、247和244個氨基酸。目前，已對人和哺乳動物脂聯素基因結構功能和基因突變等開展了大量的研究工作，已發現該基因在人上至少存在11個突變位點，該基因啟動子和內含子的C/EBP轉錄因子在脂肪細胞分化和調控脂聯素基因的表達起重要作用［8］。但是對禽類脂聯素基因的研究較晚，相關研究報道較少。

連接酶檢測反應（Ligase detection reaction，LDR）是利用高溫連接酶實現對基因多態性位點的識別。通過多重PCR （Multiplex PCR）獲得含有待檢測突變位點的基因片段，高溫連接酶一旦檢測到DNA與互補的兩條寡聚核苷酸接頭對應處存在著基因點突變類型的堿基錯配，則連接反應就不能進行，最后通過測序儀電泳讀取檢測結果。該技術屬于中、低通量的SNP分型技術，較RFLP、SSCP方法具有特異性高、檢測快速、準確率高、適用范圍廣等優點，較DNA測序SnaPshot和HRM成本低廉等優點。本試驗運用PCR-LDR方法檢測7個鴨種脂聯素基因的遺傳多態性，分析該基因T523C SNP位點在不同品種鴨中的遺傳變異情況，旨在為這7個品種鴨的分子標記輔助選育工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

56只莆田黑鴨、51只連城白鴨、46只紹興鴨、56只攸縣麻鴨、58只建昌鴨、50只北京鴨及80只高郵鴨的血樣均采自各國家級保種場。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 鴨翅靜脈采血，ACD抗凝，酚/氯仿/異戊醇法抽提基因組DNA，TE溶解后-20℃保存。瓊脂糖凝膠電泳初步檢測后，測定DNA濃度及純度OD260/OD280。

1.2.2 PCR-LDR檢測 根據GenBank的鴨Adiponectin基因序列（DQ452618），針對SNP位點，采用Primer Premier5.0 和Oligo 6.0軟件設計特異性引物。上游引物Adiponectin T523C-up：5'-ACTCTGTCCCCCAGGTTTG -3'，下游引物Adiponectin T523C-low：5'-AGTAGTAGGTGCCGGGGATG -3'。PCR反應體系為20 μL，其中包括：50 ng/μL模板1.0 μL，1×Buffer緩 沖 液2.0 μL，3 mmol/L Mg2+0.6 μL，2 mmol/L dNTPs 2 μL，1U Taq DNA 聚合酶0.2 μL，1×Q-Solution 4.0 μL，0.5 pmol/L引物混合液2 μL，ddH2O 8.2 μL。PCR反應條件為：95℃ 預變性15 min；94℃ 變性30 s，53℃ 退火1 min，72℃延伸1 min，35個循環；72℃延伸10 min。用3% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，確定其作為模板在LDR反應中加入的量。

根據LDR探針設計原則［9］設計LDR的上下游探針，上游探針5'端用磷酸化修飾（表1）。在PCR擴增產物中加入等體積ddH2O稀釋，作為連接反應的模板。LDR反應體系為：1×Buffer 1 μL，12.5 pmol/L Probe Mix 1 μL，2 U連接酶0.05 μL，100 ng/μL PCR產物1 μL，去離子水6.95 μL。LDR反應條件為：94℃ 變性2 min；94℃ 30 s，60℃ 2 min，35個循環。

表1 LDR檢測探針序列信息

1.2.3 基因分析 取1 μL LDR連接產物與1 μL ABI GS-500 ROX熒光標記分子量標準和1 μL去離子甲酰胺上樣液混合，95℃加熱變性2 min，冰中驟冷，于5% 聚丙烯酰胺和5 mol/L 尿素中3 000 V電泳2.5 h，應用GENESCANTM672軟件分析膠文件，進行數據收集、泳道線校正、數據轉換、內在分子量標準校正、遷移片段大小測量；應用Gen-mapper軟件進行數據分析和基因分型。

1.2.4 數據統計與分析 利用Excel 統計7個鴨種Adiponectin基因每種基因型的數量，運用SPSS13.0軟件統計分析基因頻率和基因型頻率，并檢驗群體內基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。

2 結果

2.1 PCR產物擴增結果

Adiponectin基因PCR產物片段大小為286 bp與設計的片段大小一致（圖1）。

2.2 LDR檢測Adiponectin基因型

Adiponectin基因T523C經LDR檢測，均顯示為3種峰圖（圖2），即有3種基因型TT、CC和TC。基因分型標準為Adiponectin基因連接產物檢測出雙峰（86±0.5）bp /（88±0.5）bp為TC基因型，單峰（86±0.5）bp為TT基因型，單峰（88±0.5）bp為CC基因。

圖1 Adiponectin基因PCR產物

圖2 Adiponectin-T523C基因分型截圖

2.3 Adiponectin基因頻率、基因型頻率及Hardy-Weinberg平衡分析

由表2可見，7個鴨種均有3種基因型：TT、TC和CC。在莆田黑鴨、紹興鴨、攸縣麻鴨、建昌鴨、北京鴨和高郵鴨中，雜合型占優勢，僅在連城白鴨中，TT型占優勢。莆田黑鴨、連城白鴨、攸縣麻鴨和北京鴨等位基因T的頻率大于等位基因C的頻率，紹興鴨、建昌鴨和高郵鴨等位基因C的頻率大于等位基因T的頻率。7個鴨種在Adiponectin基因T523C位點均處于Hardy-Weinberg平衡狀態（P>0.05）。

3 討論

表2 Adiponectin基因及基因型頻率分布

目前，關于動物脂聯素基因的研究主要集中在該基因與動物體內脂肪沉積、動物生長發育相關的研究，本試驗采用PCR-LDR方法對莆田黑鴨、連城白鴨、紹興鴨、攸縣麻鴨、建昌鴨、北京鴨和高郵鴨等不同鴨種的Adiponectin基因T523C位點單核苷酸多態性分析結果表明，僅在連城白鴨中，TT型占優勢。在長期的人工選擇與選配過程中，地方品種在某些基因座上就會漸漸地趨于純合并固定，表現為品種的保守性，而另外一些受選擇壓力相對較小的基因座則可能表現出更豐富的多態性，表現為品種的變異性。品種的保守性和變異性往往反映了它區別于另一個品種的種質特征。李慧芳等［10］對鴨的生長素基因的多態性做了分析，在所發現的3個突變位點中，連城白鴨在這3個位點均與其他8個鴨品種有明顯的差異。這是否與連城白鴨獨特的種質特征有關，還有待進一步分析研究。

不同鴨種Adiponectin基因在523位點處均發生了T→C的突變，這與董飚等［11］的研究結果相一致。家禽脂聯素基因相關的研究報道甚少，劉大林等［12］在京海黃雞脂聯素基因內含子發現C1251T突變（AY786316），該位點對腹脂重有顯著的遺傳效應；董飚等［l1］發現，家鴨脂聯素基因存在7個單堿基突變；張依裕等［13，14］對鴨脂聯素基因SNP多態與鴨肌內脂肪等指標的關聯分析提示，脂聯素基因對白羽番鴨的脂肪沉積起重要作用。但此突變位點是否會影響基因的表達還需進一步研究。

從基因型頻率的分布情況來看，本試驗中7個鴨種在T523C突變位點均處于Hardy-Weinberg平衡狀態（P>0.05），說明該位點從基因序列保守性來說比較強，在品種的選育、遷徙和遺傳漂變等因素作用下處于動態平衡當中，它們的遺傳是隨機的，基因頻率的平衡對于群體穩定性有著直接的保證作用。再者，國內鴨品種選育程度都不高，所以7個鴨種在T523C突變位點均出于遺傳平衡狀態。

4 結論

鴨Adiponectin基因T523C位點的多態性進行檢測與分析表明，7個鴨種均有3種基因型；連城白鴨中TT型占優勢，其他品種中均為雜合型占優勢；莆田黑鴨、連城白鴨、攸縣麻鴨和北京鴨等位基因T的頻率大于等位基因C的頻率，而其他品種與其相反；7個鴨種在此位點基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡狀態。

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