鹽堿地星星草根cDNA文庫的構建及初步分析

付暢 王勝楠 郭敏

（哈爾濱師范大學生命科學與技術學院，哈爾濱 150025）

同甜土植物相比，鹽生植物具有較強的耐鹽堿能力，其中蘊含著豐富的耐鹽堿基因資源，是研究植物耐鹽堿分子機制和分離耐鹽堿基因的良好材料。星星草（Puccinellia tenuiflora）是禾本科堿矛屬單子葉鹽生草本植物，耐受NaCl的最高濃度可以達到600 mmol/L，耐受Na2CO3的濃度可以達到200 mmol/L［1］，能在pH9-10以上的鹽堿地上生長發育［2］。對星星草耐鹽堿性的生理學研究已經獲得了較為系統和全面的認識［1-5］。對星星草耐受NaHCO3的轉錄應答分子機制的研究也取得了重要的進展［6-9］，鑒定了400 mmol/L NaHCO3脅迫條件下星星草基因的表達譜，以及40 g/L （～476 mmol/L）NaHCO3脅迫下星星草的差異表達基因。

根是植物抵御鹽堿脅迫的第一道防線，根對鹽堿脅迫的敏感程度制約著整個植株的產量［10］。植物感受鹽脅迫信號后將其轉變成引起根部生長和發育變化的生理過程。鹽脅迫下轉錄因子AP2/EREBP1207和MYB119的表達水平在整個根部中的變化微小，而在根尖中卻被強烈誘導［11］。這提示我們，以整株植物為材料分析鹽脅迫下的差異表達基因，可能會影響一些根部差異表達基因的檢測。因此，根是研究植物鹽堿脅迫應答機制的重要位點。

本研究以鹽堿地上生長的星星草的根為材料，利用SMART技術構建cDNA文庫，旨在為揭示星星草耐鹽分子機制、挖掘星星草耐鹽基因、培養耐鹽植物奠定重要基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

星星草根采自肇東鹽堿地。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取及mRNA的分離 采用改進的SDS法［12］從星星草根中提取總RNA，用無RNA酶的DNA酶Ⅰ去除基因組DNA污染，再用RNAclean RNA清潔純化試劑盒（原平皓公司產品）純化總RNA。用Gene Spec V核酸蛋白分析儀測定總RNA的濃度和純度。用1.2%的瓊脂糖凝膠凝膠電泳檢測 總RNA的 完 整 性。用PolyATtract?mRNA Isolation Systems（Promega公司產品）從總RNA中分離mRNA。

1.2.2 cDNA文庫的構建 以0.5 μg mRNA為模板，按照CreatorTMSMARTTMcDNA Library Construct ion試劑盒（Clontech公司產品）的說明書操作合成cDNA第一鏈，然后以其為模板通過LD-PCR（Long-distance PCR）擴增合成雙鏈cDNA。利用Sfi限制性內切酶酶切純化后的雙鏈cDNA，用CHROMA SPIN-400柱對雙鏈cDNA進行分級分離。將分級分離后的雙鏈cDNA連接到質粒載體pDNR-LIB上。將連接產物以電轉化方法（電壓1 800 V、電容25 μF、電阻200 Ω、脈沖時間5 ms）轉化大腸桿菌感受態細胞JM109。

1.2.3 cDNA文庫質量的檢測 按照CreatorTMSMARTTMcDNA Library Construct ion試劑盒（Clontech公司）說明書操作，測定文庫的滴度。挑取轉化平板上的菌落，以載體引物M13-f和M13-r進行菌落PCR篩選，以確定插入片段的大小和文庫的重組率。PCR反 應 體 系 為：1 μL 10×PCR緩 沖 液，0.8 μL dNTP（2.5 mmol/L），M13-f（10 μmol/L）和M13-r（10 μmol/L）各0.1 μL，0.1 μL rTaq （5 U/μL），用無菌牙簽在轉化平板中蘸取菌落作為模板加入反應混合物，加滅菌的去離子水至10 μL。PCR反應條件為：94℃ 預變性4 min；94℃ 30 s，56℃ 30s，72℃ 30 s，作30個循環；最后72℃ 延伸10 min。

1.2.4 ESTs的序列測定與功能注釋 隨機從平板上挑取25個陽性重組子進行測序，利用NCBI網站上的VecScreen程序去除載體序列，利用Blastx程序在NCBI Nr數據庫中對ESTs序列進行相似性比對。

2 結果

2.1 鹽堿地星星草根總RNA的提取與純化

按照改進的SDS法提取鹽堿地星星草根的總RNA。用DNaseⅠ（RNase-free）對總RNA進行消化，去除基因組DNA的污染，再用RNA清潔純化試劑盒純化消化后的總RNA。瓊脂糖凝膠電泳的檢測結果（圖1）顯示，28S rRNA與18S rRNA條帶清晰，且其亮度比例達到2∶1，表明RNA的完整性較好。紫外分光光度法的檢測結果顯示，OD260/OD280的比值為2.0，表明RNA的純度較高，可以用于下一步的反轉錄反應。

圖1 鹽堿地星星草根總RNA的電泳檢測

2.2 雙鏈cDNA的合成

用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合成的雙鏈cDNA，結果（圖2）顯示，雙鏈cDNA片段分布在0.5-2 kb之間，表明合成的cDNA雙鏈中具有較多的長片段，達到構建cDNA文庫的要求。

圖2 雙鏈cDNA 的LD-PCR產物的電泳檢測

2.3 cDNA文庫滴度的測定

按照CreatorTMSMARTTMcDNA Library Construct ion試劑盒說明書的操作，經過測定，擴增后文庫的滴度為1.747×109CFU/mL，已達到文庫構建庫容量的要求。

2.4 cDNA文庫重組率的計算

從轉化平板上隨機挑取24個單菌落，以載體引物M13-f和M13-r進行菌落PCR。用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物的結果（圖3）顯示，插入片段在0.25-1 kb之間，文庫的重組率為92%。

圖3 插入片段的檢測

2.5 cDNA文庫ESTs的序列測定與分析

從轉化平板上進一步挑取單菌落，以載體引物M13-f和M13-r進行菌落PCR篩選。隨機挑取25個陽性重組子進行測序，利用NCBI網站上的VecScreen程序去除載體序列，共測得20個ESTs序列。通過Blastx程序在NCBI Nr數據庫中對20個ESTs序列進行同源性比對的結果（表1）表明，有8條序列沒有在數據庫中找到相似的序列，9條序列與數據庫中的序列相似性較低，3條序列與數據庫中的相似性較高。

表1 鹽堿地星星草根cDNA文庫基因的Blastx分析結果

3 討論

3.1 鹽堿地星星草根cDNA文庫的構建策略與文庫質量評價

本研究采用CreatorTMSMARTTMcDNA Library Construction Kit構建了鹽堿地星星草根的cDNA文庫。采用LD-PCR技術擴增雙鏈cDNA的第二條鏈，可富集文庫中的低豐度以及稀有基因，提高文庫的代表性；利用CHROMA SPIN-400柱對cDNA進行分級分離，可有效除去小片段的cDNA，可富集低豐度的mRNA在文庫中出現的頻率，一方面保證了文庫的有效滴度；另一方面提高文庫的代表性。擴增后文庫的滴度為1.747×109CFU/mL；插入的最大片段為1 kb，插入的片段主要集中在0.75 kb左右；文庫的重組率為92%。文庫的質量符合構建cDNA文庫的要求。

3.2 cDNA文庫ESTs序列的初步分析

編號為CYJDR3-17的EST序列與一粒小麥（Triticum monococcum）、二穗短柄草（Brachypodium distachyon）、玉米（Zea mays）、大麥（Hordeum vulgare subsp. Vulgare）和茶樹（Camellia sinensis）等眾多物種的S-腺苷甲硫氨酸合成酶（S-adenosylmethionine synthetase，SAMS）基因的氨基酸序列具有較高的相似性，其中與一粒小麥、二穗短柄草和大麥的相似性達到100%。SAMS基因編碼S-腺苷甲硫氨酸合成酶，該酶可催化甲硫氨酸與ATP生成S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）。SAM在生物的生命活動中發揮重要作用，不僅是激素、核酸、蛋白質、磷脂等物質合成的甲基供體，還是多胺及乙烯合成的前體物質［13］。SAMS在植物逆境生理、衰老生理、植物生物代謝中發揮重要作用［14］。SAMS基因能被外源乙烯、鹽脅迫、滲透脅迫、氧化脅迫、高溫脅迫、低溫脅迫、鎘脅迫誘導表達［13，14］，廣泛參與多種逆境脅迫應答反應。

SAMS基因在植物的鹽脅迫應答中發揮重要作用。鹽脅迫下，SAM參與植物激素、核酸、蛋白質和磷脂等物質的合成；通過影響多胺和乙烯的含量調節植株的耐鹽性；參與植株木質化的形成，通過質外體途徑調節水分運輸和離子吸收［13］。鹽脅迫可誘導SAMS基因的表達，鹽脅迫下黃瓜SAMS基因的表達呈現出先升高后降低的趨勢［13］。野生大豆SAMS基因在煙草中的超量表達提高了轉基因煙草植株的耐鹽性［14］。SAMS基因是一個重要的耐鹽相關基因，我們從鹽堿地星星草根的cDNA文庫中篩選到的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因2的EST片段，在本研究工作的基礎上可進一步通過RACE技術克隆星星草SAMS2基因的全長cDNA以及ORF，并鑒定其功能。星星草SAMS2基因的克隆與功能鑒定有助于理解植物逆境脅迫應答反應，可為該基因的利用提供理論依據。SAMS2基因可以作為植物耐鹽基因工程的候選工具基因，有望用于培育耐鹽性較強的植物品種，改良和利用鹽堿地。

編號為CYJDR3-17的EST序列與玉米鈣牽蛋白基因的氨基酸序列具有較高相似性，達到90%。鈣牽蛋白也被稱為中心體蛋白，是真核生物基本/中心體復合物的普遍組成成分，是與鈣調素結構類似的鈣調EF-hand蛋白。Ko等［15］從1.7 mol/L NaCl條件下生長的杜氏鹽藻（Dunaliella salina）的cDNA文庫中分離了鈣牽蛋白基因DsCALT。這些信息表明，鈣牽蛋白與耐鹽性密切相關。目前關于植物鈣牽蛋白基因的研究較少，深入研究植物鈣牽蛋白基因的功能，將有助于理解植物的耐鹽分子機制。

4 結論

利用SMART技術構建了鹽堿地星星草根的cDNA文庫。擴增后文庫滴度為1.747×109CFU/mL；插入的最大片段為1 kb，插入的片段主要集中在0.75 kb左右；文庫的重組率為92%。文庫的質量滿足構建cDNA文庫的要求。從該文庫中篩選到耐鹽相關基因S-腺苷甲硫氨酸合成酶2基因和鈣牽蛋白基因的EST片段，表明該文庫可用于進一步從中篩選星星草耐鹽基因。

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