轉基因大豆GTS40-3-2 定量測定的不確定度分析

王 東，宋 君，葉先林，雷紹榮，劉文娟，常麗娟，尹 全，張富麗

（四川省農業科學院分析測試中心，四川成都610066）

從1993年國際上發布《測量不確定度表示指南》到2012年我國發布新版《測量不確定度評定與表示》（JJF1059.1—2012）超過10 a里，不確定度理論研究與評定實踐在我國得到了長足發展[1-4]。相對于計量與校準實驗室，不確定度評估在檢測實驗室的應用相對較少，主要原因可能在于檢測實驗室的檢驗報告涉及眾多參數，測量不確定度的計算非常繁瑣等[5]。

轉基因成分定量檢測是國際上主流的轉基因檢測方法，它通過測量指數時期擴增后的外源DNA數量，然后根據數學公式計算出樣品中外源DNA的原始拷貝數量[6-9]。由于該技術操作步驟繁多、微量轉移液體誤差大、熒光基團易降解等原因，導致實驗室之間檢測結果差異較大。目前，我國尚未出臺轉基因生物及產品定量標識閾值[10-11]，大多數轉基因生物檢測實驗室沒有開展測量不確定度評估工作。近年來，歐盟的轉基因生物檢測實驗室摒棄了靈敏度不高的End Point PCR（終點多聚酶鏈式反應）方法，而用靈敏度較高的Quantitative real time PCR（實時定量多聚酶鏈式反應）檢測轉基因生物并評估其測量不確定度。國際上轉基因生物測量不確定度評估，主要采用Top Down或Bottom Up[12]。

本研究采用Bottom Up途徑，參考《測量不確定度評定與表示》（JJF1059.1—2012）[13]，評估了樣品中轉基因大豆（GTS40-3-2）含量的不確定度，以期為轉基因生物檢測實驗室不確定度評估提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

本試驗以含量為100%的轉基因大豆（GTS40-3-2）粉末的DNA梯度稀釋液作為制備工作曲線的DNA模板，以含量約為3%的GTS40-3-2混合粉末（轉基因大豆GTS40-3-2粉末與非轉基因大豆粉末按照質量比為3∶97的比例均勻混合）作為測試樣品。

1.2 試劑和儀器

植物基因組DNA純化試劑盒和real time PCR Master Mix試劑盒（均購自Tiangen生物技術有限公司（北京）），超微量分光光度計（Nanodrop1000，Thermo），高速冷凍離心機（Heraeus，Thermo），7500 Real Time PCR system（Applied Biosystem Incorporation，Foster city,USA）等。

1.3 DNA 提取

稱取100%含量的GTS40-3-2粉末和含量約為3%的GTS40-3-2粉末各100 mg，按植物基因組DNA純化試劑盒（Tiangen生物技術有限公司，北京）說明書分離、純化DNA。

1.4 引物和探針

根據《轉基因產品檢測核酸定量PCR檢測方法（GB/T 19495.5—2004）》的附錄A（轉基因大豆實時熒光PCR方法）[14]中的引物、探針序列合成引物和探針。

1.5 DNA 梯度稀釋和PCR 反應體系

將分離純化得到的100%含量的GTS40-3-2粉末的DNA濃度，按照1∶5稀釋成5個質量濃度梯度：100，20，4，0.8，0.16 ng/μL。將含量約為3%的GTS40-3-2粉末的DNA濃度稀釋成50 ng/μL。取3μL上述DNA稀釋液加入到25μL反應體系：2×Taqman Master mix 12.5μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，探針（10μmol/L）0.5μL，補水至25μL。每個DNA濃度稀釋液做3個平行反應，待測樣品做16個重復測試。在ABI7500型熒光定量PCR儀器上運行反應程序：95℃變性10 min；95℃15 s，60℃1 min，共40次循環。

2 測量結果與不確定度評定

根據實時PCR指數擴增期的循環數閾值（C t值）與基因含量對數值（lg A）之間的數學關系式C t＝m×lg A＋k（A 為內源基因（Lectin）或外源基因（GTS40-3-2）的質量；C t為儀器檢測到的PCR反應循環數閾值；k為工作曲線在y軸的截距；m為工作曲線的斜率），以C t值為縱坐標，以lg A 值為橫坐標，7500 Real Time PCR system儀器自帶軟件自動擬合工作曲線，得到內、外源基因含量的線性回歸方程。

將所測樣品外源基因或內源基因的C t值代入各自的回歸方程，計算出樣品中內源基因或外源基因的質量（或拷貝數）。再根據公式C＝A外/A內×100%（C 為樣品中轉基因成分的百分含量（%）；A外為樣品中外源基因的質量；A內為樣品中內源基因的質量），計算出樣品中轉基因成分的百分含量。

2.1 檢測結果

將GTS40-3-2含量約為3%的測試樣品，進行16次重復測定，結果列于表1。

表1 測試樣品中GTS40-3-2 含量測定結果

2.2 內、外源基因工作曲線的制備

lectin內源基因和GTS40-3-2轉化事件片段的工作曲線，由ABI7500 software 2.0軟件自動擬合（表2，3）。lectin內源基因工作曲線的回歸方程為y＝-3.414x＋31.604，相關系數R2＝0.996；GTS40-3-2轉化事件片段工作曲線的回歸方程為y＝-3.457x＋29.732，相關系數R2＝0.997。

表2 內源基因lectin 工作曲線擬合

表3 GTS40-3-2 工作曲線擬合

2.3 不確定度來源

轉基因生物測量的不確定度來源主要有探針標記熒光基團分解、儀器穩定性、基因擴增效率偏差等隨機效應。此外，試驗中微量液體轉移、移液器定值偏差、內外源基因含量與熒光信號（C t值表示）的非線性偏離等都是基因定量分析結果的不確定度主要來源[15]。

2.4 標準不確定評定

2.4.1 A類標準不確定評定 A類不確定度由各類隨機效應引起，按照Bessel公式計算：

式中，xi為GTS40-3-2每次相對含量測量結果值；x 為16次重復測量GTS40-3-2相對含量的平均值；n 為測量次數。

2.4.2 B類標準不確定評定

2.4.2.1 工作曲線讀數C t值的不確定度 與lg A外對應的響應值C t外對GTS40-3-2工作曲線擬合的標準差，即回歸標準差，按照以下公式計算：

在試樣的測量次數p＝16時，最小二乘法引入的不確定度分量為：

u（A外）＝10lgA外×ln10×u（lg A）；

u（A外）＝A外×2.303×u（lg A）。

故其相對標準不確定度為：

urelA外＝u（A外）/A外＝2.303×0.010＝0.023。

同理，與lg A內對應的響應值C t內對內源基因lectin工作曲線擬合的回歸標準差為：

內源基因工作曲線的不確定度u（C t內）分量為：

u（A內）＝10lgA內×ln10×u（lg A內）；

u（A內）＝A內×2.303×u（lg A內）。

故其相對標準不確定度為：

urelA內＝u（A內）/A內＝2.303×0.016＝0.037。

按照統計原理計算得到工作曲線的不確定度，其自由度為n-2。故，νA外＝n-2＝15-2＝13；νA內＝n-2＝15-2＝13。

不同量程的移液器在加樣過程中具有測量的獨立性，因此，微量移液器允差帶來的合成相對不確定度為：

2.4.2.3 B類標準不確定度的合成 B類不確定度各分量urel外，urel內，urel移液器彼此獨立，其靈敏系數都為1，3個合成為B類標準不確定度為：

3 合成不確定度u rel

因為A類標準不確定度和B類標準不確定度彼此獨立，故：

4 擴展不確定度U

U＝k×uc，包含因子k 為置信水準（P）95%，自由度νeff為198的t 分布臨界值，按非整ν 內插計k為1.96，故U＝1.96×0.002＝0.016≈0.02。

所以，測量結果C＝0.028±0.02。

5 討論

測量不確定度是衡量實驗室檢測質量的重要尺度，一般來說不確定度越小，檢測結果與約定真值越靠近，檢測質量越高；但不確定度過小，在實驗室間的數據比對時，往往造成比對數據離群[5]。被測量的不確定度取決于各輸入量的不確定度，在評估測量結果的不確定度時，應先評定各分量的不確定度。本研究用Bessel公式估算16次重復測量GTS40-3-2含量結果的A類不確定度（uA＝0.000 8）。由于轉基因生物檢測體系一般是微量體系（50μL以內），移液誤差對檢測結果影響較大；此外，數據對之間的非線性偏離會影響工作曲線的擬合。在B類不確定評估中，重點估算了內源基因（Lectin）、外源基因（GTS40-3-2）工作曲線的不確定度（urelA內＝0.037，urelA外＝0.023）以及反應體系（25μL）制備中微量液體轉移的不確定度（urel移液器＝0.07）。在此基礎上，計算出合成了所有分量不確定度的合成不確定度（uC＝0.002）。在95%的置信水平下（νeff＝198，k＝1.96），計算出擴展不確定度（U＝0.02）。測量結果（C＝0.028±0.02）接近約定真值（0.03），測量不確定相對較小，說明轉基因大豆GTS40-3-2檢測質量較高。

從各分量的不確定度看，微量液體轉移引入的不確定度最大（0.07）。因此，在今后的測試中應重點注意微量液體轉移量的準確性，尤其應重視移液器的校準。在實驗操作中，應選用與移液器匹配較好、液體低吸附（low binding）的槍頭，盡量降低移液器帶來的不確定度。在轉基因生物檢測過程中，不同環節都可能產生不確定度[16]，如送樣種子顆粒數量與期望含量、樣品縮分、DNA分離及其濃度測量、DNA溶液稀釋、反應體系制備、熒光基團降解、工作曲線擬合等。本研究重點討論了轉基因生物檢測中微量液體的轉移和工作曲線引入的不確定度，是對轉基因成分檢測結果不確定度評定的初步嘗試，而在實際測試中，應盡可能多地對從制樣到數據分析等各個環節的不確定度進行評估，從而獲得較準確的測量不確定度。

［1］Wang CX，Shu Y.Evaluationon uncertainty of determining aspartamein beverage by HPLC[J].Agricultural Science&Technology，2009，10（5）：6-8.

［2］張涵信，查俊.關于CFD驗證確認中的不確定度和真值估算[J].空氣動力學學報，2010，28（1）：39-45.

［3］王小鵬，高志山，馬駿，等.非球面測量中零位計算全息的測量不確定度分析研究[J].光學學報，2011，31（1）：1-5.

［4］劉文彬，居漪.常規化學項目總誤差和不確定度比較研究[J].檢驗醫學，2012，27（12）：1002-1006.

［5］林瑞波.檢測實驗室參數測量不確定度評定淺析[J].中國計量，2011（8）：71-73.

［6］宋勇濤，王勇，劉勤，等.FQ-PCR在轉基因產品中的應用研究進展[J].動物醫學研究進展，2008，29（11）：55-59.

［7］馬燕斌，吳霞，蔡永峰，等.TaNHX1 基因的組織特異性表達及生物信息學分析[J].山西農業科學，2013，41（5）：422-426.

［8］田義軻，李節法，王彩虹，等.梨莖尖中PpKO 基因表達量的實時熒光定量PCR分析[J].華北農學報，2012，27（3）：62-66.

［9］王渭霞，賴鳳香，洪利英，等.實時定量PCR檢測轉基因水稻科豐6號插入拷貝數和轉基因含量[J].農業生物技術學報，2012，20（1）：9-15.

［10］劉信，宋貴文，沈平，等.國外轉基因植物檢測技術及其標準化研究綜述[J].農業科技管理，2007，26（4）：3-7.

［11］厲建萌，宋貴文，劉信，等.淺談轉基因產品閾值管理[J].農業科技管理，2009，28（3）：29-32.

［12］ Jana Zel，Kristina Gruden，Katarina Cankar，et al.Calculation of measurement uncertainty in quantitative qnalysis of genetically modified organisms using intermediate precision-A practical approach[J].Journal of AOACInternational，2007，90（2）：582-586.

［13］國家質量監督檢驗檢疫總局.JJF1059.1—2012 測量不確定度評定與表示[S].北京：中國計量出版社，2012.

［14］中國國家標準化管理委員會.GB/T19495.5—2004 轉基因產品檢測核酸定量PCR檢測方法[S].北京：中國標準出版社，2007.

［15］宋君，雷紹榮，劉勇，等.實時熒光定量PCR檢測轉基因玉米MON863結構特異基因的測量不確定度[J].安徽農業科學，2011，39（33）：20312-20315.

［16］宋君，雷紹榮，郭靈安，等.實時熒光定量PCR檢測轉基因玉米MON863的測量不確定度分析[J].玉米科學，2012，20（5）：45-49.