雜色鮑血淋巴雙向電泳與質(zhì)譜分析

韓 燾, 姜敬哲, 王江勇

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 南海水產(chǎn)研究所, 廣東 廣州510300; 2.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命科學(xué)學(xué)院, 上海201306)

雜色鮑(Haliotisdiversicolor), 肉質(zhì)鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富, 是我國(guó)南方重要的鮑養(yǎng)殖品種, 是中華民族的傳統(tǒng)珍饈佳肴。近年來(lái)養(yǎng)殖環(huán)境日益惡化, 鮑病害呈現(xiàn)爆發(fā)性的增長(zhǎng)趨勢(shì), 對(duì)鮑養(yǎng)殖業(yè)造成了極大損 害[1-2]。然而, 從分子水平上對(duì)其先天免疫系統(tǒng)以及免疫因子的研究還十分有限, 客觀上限制了鮑病害防控技術(shù)的發(fā)展[3]。

雙向電泳(Two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE)是1975年建立的[4], 現(xiàn)廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷、藥物篩選[5]、毒性機(jī)理[6-7]、免疫機(jī)制[8]和水產(chǎn)動(dòng)物的生理調(diào)控機(jī)制[9]等研究。

雙向電泳技術(shù)作為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要技術(shù), 可以從整體、動(dòng)態(tài)水平上大規(guī)模、高通量地對(duì)總蛋白的分子組成和相互作用規(guī)律進(jìn)行研究, 定量觀察病害發(fā)生過(guò)程中蛋白質(zhì)種類和數(shù)量的變化, 能更直接地了解致病機(jī)理和免疫機(jī)制, 為病害防治提供依據(jù)[10-11]。但雙向電泳對(duì)研究者技術(shù)要求較高, 不同研究材料需要建立不同的雙向電泳體系。目前針對(duì)海洋無(wú)脊椎動(dòng)物已經(jīng)建立的雙向電泳體系包括: 西施舌(Coelomactra antiquata)的外套膜[12]、紫貽貝(Mytilus galloprovincialis)的消化腺[5]、泥蚶(Tegillarca granosa)的肌肉[13]、藍(lán)斑背肛海兔(Notarchus leachii cirrosusStimpson)和褐云瑪瑙螺(Achatina fulica(Ferussae))的大腦神經(jīng)節(jié)(cerebral ganglion,CG)[6]、縊蟶(Sinonovacula constricta)[14]和牡蠣(Bonamia ostreae)[8]的血淋巴、南美白對(duì)蝦(Penaeus vannamei)的血細(xì)胞[15]、中國(guó)明對(duì)蝦(Fenneropenaeus chinensis)的血漿[16]以及雜色鮑的肝胰腺[7]等。

本文首次以雜色鮑血淋巴總蛋白為研究對(duì)象, 成功建立了雙向電泳技術(shù)平臺(tái)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

雜交鮑(遺傳背景不祥)購(gòu)自廣州下渡市場(chǎng), 平均質(zhì)量(30±5)g; 其他試驗(yàn)均使用購(gòu)自汕尾市粵順海珍品養(yǎng)殖有限公司的雜色鮑, 平均質(zhì)量為(20±5)g, 暫養(yǎng)于水溫15~18.5℃、鹽度30、50 cm×30 cm×40 cm玻璃缸(帶循環(huán)水和泵氧設(shè)備)中。

1.2 試劑與儀器

固相pH梯度干膠條IPG strip非線性(pH 3-10, 18 cm)、兩性電解質(zhì)IPG buffer(pH 3-10)和Drystrip Cover Fluid等購(gòu)自美國(guó)GE Healthcare公司; 丙磺酸(CHAPS)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、四甲基乙二胺(TEMED)、尿素(Urea)、硫脲(Thiourea)、二硫蘇糖醇(DTT)和碘乙酰胺(IAA)等購(gòu)自美國(guó)Sigma公司; 乙醇、冰醋酸、Na2S2O3等均為國(guó)產(chǎn)分析純; 蛋白標(biāo)準(zhǔn)2-D Protein MW Marker購(gòu)自TaKaRa公司; 蛋白酶抑制劑 Protease &Phosphatease Inhibitor Single-Use Cocktail, EDTA-free(100×)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司; 蛋白定量試劑盒(RC DC Protein Assay)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司; BCA、Bradford蛋白定量試劑盒購(gòu)自香港昊柏生物公司, Lowry改良試劑盒購(gòu)自美國(guó)andybio公司。

等電聚焦儀EttanIPGphor 3、ImageScanner掃描儀、ImageMaster 2D Platinum 7.0圖像分析軟件等購(gòu)自美國(guó)GE Healthcare公司; 垂直電泳Protean Ⅱ XL系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司; 凍干機(jī)為美國(guó)Virtis公司Advantage桌上型冷凍干燥機(jī); 純水系統(tǒng)(ELGA PURELAB CLASSIC)購(gòu)自英國(guó)ELGA公司。

1.3 蛋白樣品的制備與定量

1.3.1 血淋巴樣品的制備

血細(xì)胞和血漿的分離: 用解剖刀劃開(kāi)鮑腹足表面, 取血淋巴于離心管中, 500 r/min, 4℃離心5 min, 上清即為血漿, 沉淀為血細(xì)胞, 沉淀留在離心管中; 大分子血藍(lán)蛋白的去除: 35 000 r/min, 4℃, 2 h, 棄沉淀, 取上清。

1.3.2 血淋巴和血漿總蛋白的提取

取血淋巴或血漿5 mL, 加入4倍體積的預(yù)冷丙酮, 攪拌均勻后–20℃沉淀過(guò)夜; 12 000 r/min, 4℃, 離心15 min, 棄上清; 重懸沉淀于預(yù)冷丙酮, –20℃沉淀3 h; 12 000 r/min, 4℃, 離心15 min, 棄上清; 重復(fù)前兩個(gè)步驟1次; 加入少量預(yù)冷丙酮, 將混合均勻的蛋白丙酮液分裝入1.5 mL離心管中, 每管0.2 mL; 12 000 r/min, 4℃, 離心15 min, 棄上清液; 用真空濃縮機(jī)抽干剩余丙酮, 直到樣品完全干燥; 將制備好的蛋白丙酮干粉置于–80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 蛋白的溶解與定量

取血淋巴或血漿總蛋白的丙酮干粉, 或取血細(xì)胞沉淀, 按1∶10(W∶V)加入裂解液(7 mol/LUrea、2 mol/LThiourea、2% CHAPS、40 mmol/L DTT和0.5 % IPG Buffer), 振蕩溶解, 冰上超聲促融, 功率80 W, 周期0.5, 60次。12 000 r/min, 4℃離心30 min, 取上清即為蛋白樣品。使用RC DC Protein Assay進(jìn)行蛋白定量。

1.4 雙向電泳

1.4.1 等電聚焦電泳

使用18 cm pH 3-10 IPG非線性膠條, 總蛋白量80~150 μg, 上樣體積340 μL(血淋巴上樣量150 μg時(shí)加入5 μL 2-D Protein MW Marker), 被動(dòng)水化上樣16 h。

參照IPGphor等電聚焦指南設(shè)置程序: 500 V 1 h、1 000 V 1 h、8 000 V 3 h、8 000 V 2 h、500 V保持。每根膠條電流50 μA, 溫度20℃。

1.4.2 膠條平衡

采用兩步平衡法, 每步15 min, 平衡液為6 mol/L urea, 2% SDS, 75 mmol/L Tris-HCl, 20%甘油, 1% DTT, 體積10 mL, 第二步平衡時(shí)用2.5% IAA代替DTT。

1.4.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)

SDS-PAGE電泳膠濃度為12%。將平衡后的IPG膠條轉(zhuǎn)移至SDS凝膠上端, 用0.5%瓊脂糖溶液封頂。電泳參數(shù)設(shè)置: 50~100 V, 直至溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)底部邊緣時(shí)電泳結(jié)束。

1.5 凝膠染色、掃描及圖像分析

1.5.1 銀染(每塊凝膠使用250 mL的溶液體系)

固定 30 min(乙醇100 mL, 冰醋酸25 mL, 用超純水定容至250 mL); 敏化 30 min(乙醇75 mL, Na2S2O30.5 g, NaAc17 g, 定容至250 mL); 漂洗 5 min×3(250 mL); 銀染 20 min(AgNO30.625 g, 定容至 250 mL); 漂洗 1min×2(250 mL); 顯色 5~10 min(Na2CO36.25 g, 甲醛0.1 mL(使用前加入), 定容至250 mL; 此步通過(guò)肉眼觀察確定具體時(shí)間); 終止 10 min(EDTA-2Na 4.165 g, 冰醋酸25 mL, 定容至250 mL); 漂洗5 min×3(250 mL)。

1.5.2 凝膠掃描及圖像分析

凝膠用 ImageScanner掃描儀掃描, 并用ImageMaster 2D Platinum 7.0圖像分析軟件對(duì)掃描圖譜處理分析。

1.6 質(zhì)譜分析

為檢驗(yàn)雙向電泳凝膠與質(zhì)譜的兼容性, 同時(shí)也為建立蛋白樣品本身蛋白標(biāo)記以防止蛋白Marker對(duì)其他蛋白點(diǎn)的影響, 選取4個(gè)蛋白點(diǎn), 切割后置于1.5 mL 離心管中, 送至暨南大學(xué)生命與健康工程研究院使用ABI 4800 plus MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。

2 結(jié)果

2.1 樣品制備與蛋白定量方法的選擇

樣品制備先后嘗試了3種方法: 直接裂解液處理、凍干法和丙酮沉淀法。直接裂解液處理是將血漿與裂解液按比例直接混合, 混合后出現(xiàn)大量沉淀。凍干法制備的血漿干粉可以較好地溶于裂解液, 但蛋白定量時(shí)加入的BCA和Bradford等試劑會(huì)產(chǎn)生大量沉淀, 干擾定量。改用丙酮沉淀法提取的蛋白干粉與幾種蛋白定量試劑兼容良好, 無(wú)沉淀, 可準(zhǔn)確定量。但當(dāng)丙酮沉淀的蛋白干粉溶于裂解液后, 裂解液成分與部分定量試劑不能很好兼容: 如使用改良Lowry法測(cè)得的線性R2值只有0.3072, Bradford法的為0.9332, RC DC法的最高, 為0.9941(圖1)。后續(xù)蛋白定量均使用RC DC法。

圖1 RC DC蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)曲線 Fig. 1 Standard curve of RC DC protein quantitative

2.2 不同血淋巴組分的比較

實(shí)驗(yàn)中比較了雜交鮑的兩種血淋巴組分樣品(血漿和血細(xì)胞)的電泳結(jié)果, 如圖2所示。兩個(gè)樣品蛋白組成差異明顯, 血漿樣品(即去除血細(xì)胞后的血淋巴)的蛋白點(diǎn)較多, 分離效果良好, 而血細(xì)胞樣品的蛋白點(diǎn)較少, 中間偏上位置的蛋白點(diǎn)分離效果有限, 多成串狀分布, 可能為經(jīng)過(guò)復(fù)雜修飾后的膜蛋白。

2.3 血藍(lán)蛋白的去除

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 在電泳凝膠上端有大量高分子質(zhì)量蛋白, 多為血藍(lán)蛋白[16-18]。本研究通過(guò)超速離心去除了多數(shù)的高分子質(zhì)量血藍(lán)蛋白, 如圖3所示。經(jīng)過(guò)超速離心后, 凝膠頂端聚集的蛋白明顯減少, 其他分子質(zhì)量蛋白變化不明顯。

圖2 雜交鮑2種不同血淋巴組分的雙向電泳圖 Fig. 2 2-DE maps of two different hemolymph components of hybrid abalone

圖3 超離前后雙向電泳凝膠上端比較 Fig. 3 Comparison top parts of 2D-PAGE maps before and after ultracentrifugation

2.4 不同上樣量的電泳效果

實(shí)驗(yàn)中比較了3種上樣量的電泳效果, 如圖4所示。3次實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性較好。上樣量80 μg時(shí), 凝膠中間偏上部份的分離效果最好, 但總蛋白點(diǎn)數(shù)較少, 只有234個(gè); 上樣120 μg時(shí), 凝膠中上部的背景加深, 點(diǎn)數(shù)增多至264個(gè); 上樣150 μg時(shí), 點(diǎn)數(shù)增多不明顯(276個(gè)), 凝膠中上部背景較高, 但其他區(qū)域低豐度蛋白點(diǎn)信號(hào)有所增強(qiáng)。

2.5 質(zhì)譜鑒定

所選4個(gè)蛋白點(diǎn)二級(jí)質(zhì)譜結(jié)果: 1為肌動(dòng)蛋白, 2為原肌球蛋白, 3為血藍(lán)蛋白1型亞基, 4為膠原蛋白, 圖5為所選蛋白點(diǎn)的凝膠位置顯示, 圖6中A-D為蛋白一級(jí)質(zhì)譜圖, 表1為蛋白信息。

4個(gè)蛋白點(diǎn)的質(zhì)譜結(jié)果與凝膠圖譜比較, 2號(hào)點(diǎn)的理論值與圖中觀測(cè)值一致, 1、3、4號(hào)點(diǎn)的理論等電點(diǎn)與圖中觀測(cè)值有差異, 3、4號(hào)點(diǎn)的理論分子質(zhì)量與圖中觀測(cè)值有差異。

圖4 不同上樣量的雜色鮑血淋巴總蛋白2-DE圖譜(銀染) Fig. 4 2-DE maps of Haliotisdiversicolor hemolymphtotal protein with different loading amounts (silver staining)

圖5 上樣量150 μg的雜色鮑血淋巴總蛋白2-DE圖譜(銀染) Fig. 5 2-DE maps of Haliotis diversicolor hemolymphtotal protein with 150 μg loading amounts (silverstaining)

3 討論

3.1 研究材料的選擇與前處理

節(jié)肢動(dòng)物及大多數(shù)的軟體動(dòng)物都為開(kāi)放式循環(huán)系統(tǒng), 它們的血淋巴(體液)從心臟流出后被直接輸送到體內(nèi)各組織中, 在它們回到心臟之前, 會(huì)與機(jī)體的多數(shù)組織液充分混合并產(chǎn)生交換。因此, 這些動(dòng)物的血淋巴組成非常復(fù)雜, 攜帶各種功能蛋白、小分子多肽以及生化代謝物, 機(jī)體的任何一種生理變化都可能在血淋巴成分變化中反應(yīng)出來(lái)[19-20]。例如: 對(duì)縊蟶血淋巴蛋白組的研究發(fā)現(xiàn), 高溫應(yīng)激下血淋巴中多種蛋白發(fā)生了變化, 最終鑒定出鋅指蛋白和chelonianin蛋白[14]; 對(duì)牡蠣血淋巴蛋白的合成、誘導(dǎo)、上調(diào)和下調(diào)的研究將有助于理解免疫機(jī)制和抑制病害感染[8]。

本研究以腹足綱的鮑為材料, 其肌肉裸露, 只需劃開(kāi)腹足即可方便地采集血淋巴樣品。考慮到血淋巴組分過(guò)于復(fù)雜, 為了降低背景、簡(jiǎn)化問(wèn)題, 研究中還對(duì)鮑血淋巴樣品進(jìn)行了分級(jí)處理。首先, 通過(guò)低速離心有效分開(kāi)了血細(xì)胞與血漿組分(圖2), 減少了血細(xì)胞蛋白與血漿蛋白的相互干擾; 其次, 通過(guò)超速離心方法[17,21]有效降低了高分子質(zhì)量血藍(lán)蛋白的干擾(圖3), 一定程度上降低了背景, 增加了低豐度蛋白的檢出概率。雖然之前Zhou等[7]以雜色鮑肝胰腺為材料進(jìn)行了雙向電泳研究, 但以鮑血淋巴為材料的蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。該技術(shù)方法的建立不僅為鮑免疫抗病研究提供保障, 還將為鮑機(jī)體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝、生長(zhǎng)信號(hào)調(diào)控和物質(zhì)運(yùn)輸?shù)确矫娴难芯看蛳铝己没A(chǔ)。

3.2 總蛋白制備及上樣量的選擇

總蛋白的制備與準(zhǔn)確的上樣量是影響雙向電泳結(jié)果的重要因素。本研究綜合考慮了三種蛋白制備方法。直接裂解液處理和凍干法操作簡(jiǎn)單且蛋白損失少, 但由于溶解或定量過(guò)程中出現(xiàn)大量纖維蛋白沉淀, 干擾后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行, 因此放棄。雖然丙酮沉淀法步驟繁瑣, 過(guò)程中會(huì)損失一些蛋白, 但為保證實(shí) 驗(yàn)的重復(fù)性和電泳效果, 最終以獲得蛋白純度最高、定量最準(zhǔn)確的丙酮沉淀法作為總蛋白制備方法。實(shí)踐證明, 該方法所得蛋白點(diǎn)總數(shù)依然達(dá)到了276(圖4), 能夠滿足研究需要。

圖6 4個(gè)蛋白點(diǎn)的MALDI-TOF/MS 肽質(zhì)量指紋圖譜 Fig. 6 MALDI-TOF/MS peptide mass fingerprint (PMF) spectra in geltryptic digest of four protein spots

表1 4個(gè)蛋白點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定結(jié)果 Table. 1 The identification results of four protein spots

文中還對(duì)3種不同上樣量血淋巴總蛋白進(jìn)行了比較。發(fā)現(xiàn)上樣120 μg時(shí)圖像最清晰, 背景較淺, 適合圖像分析及高豐度蛋白點(diǎn)的鑒定; 而150 μg的背景相對(duì)較深, 不適用于圖像分析, 但有利于低分子質(zhì)量蛋白的研究。由此可知, 上樣量的選擇應(yīng)該依研究需要而定, 不同的血淋巴組分還需依實(shí)際情況而定。

3.3 質(zhì)譜分析與蛋白鑒定

一些低豐度蛋白可能具有很重要的功能, 而考染的分辨率較低, 因此, 本實(shí)驗(yàn)?zāi)z染色方法使用銀染。但是傳統(tǒng)銀染與目前的MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜技術(shù)不兼容, 預(yù)實(shí)驗(yàn)使用傳統(tǒng)銀染時(shí)選取3個(gè)蛋白點(diǎn)均未鑒定成功, 后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)銀染方法進(jìn)行改進(jìn), 在敏化液中不加戊二醛、銀染液中不加甲醛, 蛋白點(diǎn)數(shù)(276)能滿足實(shí)驗(yàn)需要, 之后選取4個(gè)蛋白點(diǎn)均鑒定成功, 說(shuō)明兼容性好, 改進(jìn)的銀染方法可行。

蛋白點(diǎn)的質(zhì)譜結(jié)果與凝膠圖譜比較, 其中2號(hào)點(diǎn)的理論值和圖中觀測(cè)值基本一致, 且總離子得分值與總離子一致性都很高, 說(shuō)明該蛋白點(diǎn)與數(shù)據(jù)庫(kù)中蛋白完全吻合, 并進(jìn)一步證明本研究所建立的雙向電泳和質(zhì)譜方法是可靠的; 1、4號(hào)兩個(gè)點(diǎn)的總離子得分分別只有10、12, 說(shuō)明這兩個(gè)蛋白與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知蛋白只有小段序列匹配, 但兩個(gè)質(zhì)譜結(jié)果的總離子一致性(即可靠性)均大于95%, 說(shuō)明結(jié)果是可靠的, 進(jìn)一步考慮到1、4號(hào)兩點(diǎn)的等電點(diǎn)或分子質(zhì)量與數(shù)據(jù)庫(kù)中數(shù)據(jù)并不一致, 說(shuō)明它們可能是不同于數(shù)據(jù)庫(kù)中蛋白的同源或相似蛋白; 3號(hào)點(diǎn)的等電點(diǎn)的兩個(gè)值有差異而且圖中觀測(cè)分子質(zhì)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于理論值, 但是總離子得分值很高, 即匹配肽段較多, 由此可推測(cè)該蛋白是血藍(lán)蛋白在裂解液中裂解成的片段或者本身分解的功能肽段。

文中所鑒定的肌動(dòng)蛋白是貝類肌肉中的肌原纖維蛋白的重要組成部分, 是重要的結(jié)構(gòu)蛋白之一, 可影響并調(diào)控肌動(dòng)球蛋白之間的相互作用[13]。原肌球蛋白是細(xì)肌絲中與肌動(dòng)蛋白的結(jié)合蛋白, 主要作用是加強(qiáng)和穩(wěn)定肌動(dòng)蛋白絲, 并在肌肉收縮的調(diào)節(jié)中起重要作用[22]。膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)中最重要的組成部分, 功能是維持皮膚和組織器官的形態(tài)和結(jié)構(gòu), 也是修復(fù)各損傷組織的重要原料物質(zhì)[23]。上述三種蛋白均為結(jié)構(gòu)蛋白。血藍(lán)蛋白是節(jié)肢動(dòng)物和軟體動(dòng)物血淋巴中的一種多功能蛋白, 它在以完整蛋白發(fā)揮功能的同時(shí), 其多樣的降解肽段也在發(fā)揮著重要的生物功能[24-25]。本實(shí)驗(yàn)鑒定的3號(hào)蛋白點(diǎn)是血藍(lán)蛋白中未見(jiàn)報(bào)道的新肽段, 對(duì)血藍(lán)蛋白的研究具有一定意義。

4 結(jié)論

以鮑血淋巴為研究材料, 通過(guò)對(duì)樣品前處理、總蛋白制備與定量、雙向電泳條件、顯色方法、數(shù)據(jù)處理與分析方法的摸索, 最終成功建立了以雙向電泳為基礎(chǔ)的鮑血漿蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法。該方法的建立將為鮑免疫防御機(jī)理研究等提供技術(shù)保障。

[1] Wang J Y, Guo Z X, Feng J, et al. Virus infection in cultured abalone,HaliotisdiversicolorReeve in Guangdong province, China[J]. Journal of Shellfish Research, 2004, 23: 1163-1168.

[2] 王江勇, 孫秀秀, 王瑞旋, 等. 雜色鮑肌肉萎縮癥病原菌的分離鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析[J]. 南方水產(chǎn), 2010, 6(5): 21-26.

[3] 姜敬哲, 張微, 王江勇, 等. 哈維氏弧菌感染的雜色鮑全組織均一化cDNA文庫(kù)的構(gòu)建[J]. 南方水產(chǎn), 2010, 6(5): 37-42.

[4] O’Farrell P H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins[J]. Thejournal of biologicalchemistry, 1975, 250: 4007-4021.

[5] Dondero F, Negri A, Boatti L, et al.Transcriptomic and proteomic effects of a neonicotinoid insecticide mixture in the marine mussel(Mytilusgalloprovincialis, Lam.)[J]. Science of the Total Environment, 2010, 15: 3775-3786.

[6] 詹懌婕. 三種軟體動(dòng)物大腦神經(jīng)節(jié)的蛋白質(zhì)組學(xué)的研究[D]. 廈門(mén): 廈門(mén)大學(xué)碩士論文, 2007: 10.

[7] Zhou J, Cai Z H, Li L, et al. A proteomics based approach to assessing the toxicity of bisphenol A and diallyl phthalate to the abalone (Haliotisdiversicolorsupertexta)[J]. Chemosphere, 2010, 79:595-604.

[8] CaoA, Fuentes J, Comesa?a P, et al. A proteomic approach envisaged to analyse the bases of oyster tolerance/resistance to bonamiosis[J].Aquaculture, 2009, 295:149-156.

[9] Smith R W, Wood C M,Cash P, et al. Apolipoprotein AI could be a significant determinant of epithelial integrity in rainbow trout gill cell cultures:A study in functional proteomics[J]. Biochimicaet Biophysica Acta, 2005, 1749:81-93.

[10] Somiari R I, Sullivan A, Russell S, et al. High-throughput analysis of human infiltrating ductal carcinoma of the proteome breast[J]. Proteomics, 2003, 3: 1863-1873.

[11] He Q Y, Chen J, Kung H E, et al. Identification of tumor-associated proteins in oral tongue squamous cell carcinoma by proteomics[J]. Proteomics, 2004, 4: 271-278.

[12] 田美, 申欣, 程漢良, 等. 西施舌外套膜蛋白質(zhì)組雙向電泳體系的構(gòu)建[J]. 海洋科學(xué), 2009, 33(11): 32-36.

[13] 李太武, 詹壟, 蘇秀榕. 泥蚶(Tegillarcagranosa)肉質(zhì)的蛋白組學(xué)研究[J]. 海洋與湖沼, 2008, 39(6): 678-682.

[14] 張鷺, 陳寅山, 彭宣憲. 溫度應(yīng)激下縊蟶血淋巴蛋白質(zhì)組的比較研究[J]. 畜牧與獸醫(yī), 2004, 36(6): 1-3.

[15] Chongsatja P, BourchookarnA, Lo C F, et al. Proteomic analysis of differentially expressed proteins inPenaeus vannameihemocytes upon Taura syndrome virus infection[J]. Proteomics, 2007,7: 3592-3601.

[16] 黃冰心. 基于凝膠電泳的中國(guó)明對(duì)蝦血漿蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D]. 北京: 中國(guó)科學(xué)院研究生院, 2008.

[17] 彭文, 王江勇, 丁雪娟. 雜色鮑血藍(lán)蛋白的分離純化及其酚氧化酶活性研究[J]. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 2010, 17(1): 52-57.

[18] 彭文, 姜敬哲, 王江勇, 等. 理化因子對(duì)雜色鮑血藍(lán)蛋白酚氧化酶活性影響的研究[J]. 南方水產(chǎn), 2005, 6 (2): 1-6.

[19] 姚翠鶯. 免疫刺激后中國(guó)明對(duì)蝦血液抗菌力應(yīng)答及兩種免疫相關(guān)因子LYZ和AK的研究[D]. 北京: 中國(guó)科學(xué)院研究生院, 2005.

[20] 郭志勛, 馮娟, 王江勇. 斑節(jié)對(duì)蝦血淋巴細(xì)胞對(duì)鰻弧菌的清除作用[J]. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 2006, 13(1): 28-31.

[21] 王寶杰, 劉梅, 蔣克勇, 等. 中國(guó)明對(duì)蝦血漿蛋白質(zhì)組學(xué)研究中高豐度蛋白的超速離心去除技術(shù)[J]. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 2010, 17(4): 695-700.

[22] 楊靜嫻. 原肌球蛋白的分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2004, 26(2): 144-147.

[23] 張銳, 許永安.水產(chǎn)膠原蛋白的特性及應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 福建水產(chǎn), 33(2): 79-83.

[24] Destoumieux-Garzón D, Saulnier D, Garnier J, et al. Crustacean immunity: Antifungal peptides are generated from the C terminus of shrimp hemocyanin in response to microbial challenge[J]. The journal of biological chemistry, 2001, 276: 47070-47077.

[25] 章躍陵, 葉向群, 陳潔輝, 等. 凡納濱對(duì)蝦28.5kD血藍(lán)蛋白的降解新片段[J].中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 2008, 15: 425-430.