赤點石斑魚精子的超低溫冷凍及短期保存

鄭樂云, 黃種持, 危林丹, 黃長江, 董巧香

(1. 福建省水產研究所, 福建 廈門 361012; 2. 溫州醫學院 水域生態與環境科學研究所, 浙江 溫州 325035)

赤點石斑魚(Epinephelus akaara)俗稱紅斑, 分布于北太平洋西部、中國東海南部以及南海。其色澤鮮艷、肉質細嫩, 屬高檔經濟魚類, 因其售價高昂、便于活體運輸、經濟效益極高, 近年來, 受到越來越多的養殖戶青睞。目前, 赤點石斑魚苗來源包括從海域捕撈的野生苗以及通過人工繁殖培育的人工苗。由于多年的過度捕撈, 野生赤點石斑魚數量大幅度減少, 已被《世界自然保護聯盟瀕危物種紅色名錄》收錄[1], 其野生苗的捕撈量也呈逐年減少的態勢。因此, 增加人工苗的培育和養殖, 更符合海洋漁業資源可持續利用的發展趨勢。

赤點石斑魚人工魚苗的繁殖雖已獲得成功, 但其規模仍受到一定程度的限制[2-3]。究其原因, 在于其獨特的性別分化模式, 赤點石斑魚為雌雄同體, 雌性先熟, 到一定年齡再由雌性轉變為雄性。在自然海區性轉化的年齡約為6齡以上, 人工養殖條件下亦需3a以上才開始從雌魚轉化為雄魚[4-6]。因此, 不管是在自然海區捕撈還是人工養殖的赤點石斑魚, 成熟雄魚所占的比例均較少, 僅少量可作為人工繁殖的雄性親魚, 育苗過程中經常出現精子稀缺的情況。所以, 將赤點石斑魚的精子予以適當的保存, 可有效地緩解育苗過程中雄魚精子不足的問題, 為人工育苗提供更多的優質受精卵。根據實際需要, 赤點石斑魚精子的保存可以從長期保存和短期保存兩個方面入手。超低溫冷凍技術可以實現赤點石斑魚精子的長期保存, He等[7]通過在原有石斑魚精子凍存液中加入環糊精膽固醇復合物, 成功地提高了凍精質量, 但其研究中未針對赤點石斑魚凍精受精能力予以報道, 而赤點石斑魚精子的短期保存, 仍未見報道。本研究從貼近應用的角度, 對赤點石斑魚精子的激活特點、超低溫冷凍方案篩選、受精實驗、短期保存等方面進行了詳細的探索, 從而為野生赤點石斑魚種質資源的保護、規模人工育苗提供有力的技術支持。

1 材料與方法

1.1 親魚

2012年5月13日購于廣東省饒平縣, 共190尾, 親魚體質量600～750 g/尾, 當日運至福建廈門小嶝島石斑魚研究基地, 于室內魚池暫養。每日投喂藍圓鲹(Decapterus maruadsi)、刷池底、換水100%, 并進行常規的消毒防病處理, 從中選取雄魚19尾, 雌魚10尾用于該項研究。

1.2 精子的獲取

親魚于室內暫養一周后, 陸續對雄魚采集精子。采集精子時, 首先將雄魚置于含丁香酚10～20 g/m3的水體中麻醉; 待雄魚不再掙扎時, 將之撈起, 用純凈水清洗生殖孔及其附近的魚體表面, 之后, 用吸水紙將生殖孔周圍的水份吸干; 輕擠雄魚腹部, 待精液流出泄殖孔后用移液器將其吸取并移入離心管中備用。取精過程中應避免尿液以及糞便污染; 取精之后的雄魚立即放入新鮮海水中予以復蘇; 獲取的精液立刻置于4℃的冰箱中備用。各雄魚精液的基本參數見表1。

1.3 海水比重對于精子激活的影響

以新鮮海水(溫度25℃, 比重1.022)作為初始溶液向其中添加粗鹽, 獲得比重分別為1.024、1.026、1.028等3種不同的海水, 通過加入純凈水來獲得1.020、1.018、1.016、1.014、1.012、1.010 6種不同比重的海水。10個不同比重梯度的海水, 以10: 1(體積比, 海水體積: 鮮精體積, 鮮精用量1 μL)的比例激活隨機抽取的6條雄魚的鮮精, 混勻后取10 μL于干凈的載玻片上涂開, 并在100倍放大的暗視野下觀察, 以前向運動的精子所占百分比記錄為精子的活力。通過鹽度計以及滲透壓儀(德國GONOTEC公司 OSMOMAT-30-M型)測定不同比重海水相應的鹽度和滲透壓(表2)。本實驗包含6個生物重復, 無技術重復。

1.4 冷凍速率(高度)的篩選

冷凍裝置: 泡沫盒厚度為5 cm,內部空間長21 cm,寬18 cm,高22 cm。冷凍時, 先在泡沫盒內加入4 cm高的液氮, 再將樣品放置在漂浮于液氮上的泡沫船上(泡沫船長15 cm,寬10 cm,根據需要選擇高度)。

凍存過程: 選擇6份活力均為85%的雄魚鮮精, 各取5 μL, 用含1%NaCl、10%DMSO、10 g/L BSA(牛血清白蛋白)的凍存液按10: 1的比例予以稀釋, 混勻后裝入麥管并做好標記(麥管體積250 μL, 裝管體積50 μL, 麥管再裝入直徑為1 cm的塑料套管中)。之后, 于4℃冰箱中平衡10 min。接下來將裝有麥管的塑料套管置于液氮面上方1 cm處熏蒸10 min, 之后將塑料套管取出, 迅速安裝到鋁制支架上并投入液氮中保存。余下3個高度(3、7、15 cm)操作均與1 cm高度的處理組相同。本實驗包含6個生物重復, 無技術重復。

精子解凍以及活力觀察: 精子在液氮中保存過夜后取出, 迅速轉入40℃溫水中解凍7 s。精子解凍后立刻取出1 μL與10 μL比重為1.018的海水混勻激活, 觀察精子活力。

1.5 冷凍保存液的比較

凍存液的配制: 凍存液A由生理鹽水與DMSO按9: 1(體積比)的比例配制而成; 凍存液B則是在凍存液A的基礎上加入海藻糖(阿拉丁試劑), 使得海藻糖的終質量濃度為30 g/L; 凍存液C由1%NaCl溶液與DMSO按9: 1(體積比)比例混勻, 并加入牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, BSA, 阿拉丁試劑)使得BSA的終質量濃度為10 g/L。

凍存過程: 選擇6份活力均為85%的雄魚鮮精, 各取30 μL, 每份鮮精平均分成3份, 分別用A、B、C 3種稀釋液以10: 1的體積比予以稀釋, 再將每份稀釋后的精子樣品分裝入兩支250 μL容量的麥管中(裝管體積 50μL), 從而獲得兩個亞樣, 并裝入塑料套管。4℃平衡10 min后, 于液氮上方7 cm處熏蒸10 min, 之后將塑料套管取出, 迅速安裝到鋁制支架上并投入液氮中保存。本實驗包含6個生物重復, 2個技術重復。

精子解凍以及活力觀察: 同1.4。

1.6 受精實驗

卵子獲取: 選擇腹部膨大的雌魚10條, 予以催產(HCG 100 IU/kg, LHRH-A3 1 μg/kg, 杭州動物藥品廠)。催產24 h后觀察卵子是否成熟。通過擠壓雌魚腹部獲取部分卵子置于比重為1.022的海水中觀察, 選擇浮卵率70%以上的卵子進行受精實驗。

受精: 選取3條雄魚的鮮精以及凍精(凍存液B,7 cm高度), 分別與3條雌魚的卵子在燒杯中混合(每個處理約使用卵子400個, 控制精子卵子的比例約為200000: 1), 然后使用100 mL比重為1.018的海水予以激活, 10 min后再加入比重為1.022的海水900 mL并計數各燒杯中浮卵的數量。1.5 h后, 觀察到卵裂作為受精成功的標志。受精率=(卵裂數/浮卵數)×100%。本實驗包含3個生物重復, 3個技術重復。

1.7 赤點石斑精子的短期保存

選擇3份活力為85%的雄魚精子, 每份樣本中取出40 μL, 并均分成兩份, 其中1份用等體積的Hank’s溶液稀釋, 剩下一份不做處理作為對照, 并置于4℃冰箱中保存。每隔兩天從各個處理組取精子懸液1 μL檢查精子活力, 直至精子活力均為0。本實驗包含3個生物重復, 3個技術重復。

1.8 數據處理

使用統計軟件SPSS 17.0對數據進行統計處理。結果均以均數±標準差的形式表示; 對各組間的精子活力進行方差分析; 鮮精、凍精受精率采用配對t檢驗分析;P＜0.05有顯著性差異。

2 結果

2.1 鮮精參數

從19條赤點石斑雄魚獲取的精液, 體積、精子濃度、活力分別為: (0.17±0.15) mL 、(9.94±3.01)×109個/mL和(79.21±7.31)%, 三者變異系數分別為86.55%、30.33%和9.23%。可見, 從不同雄魚所采集到的精液量差異較大、精子濃度差異次之, 活力的差異最小。其中13條雄魚的精子活力≥80%, 合計2.83 mL, 可滿足實驗需求(表1)。

2.2 海水比重對于精子激活的影響

海水的比重對于精子激活的影響, 總體呈現先迅速升高然后緩慢下降的趨勢。在水溫為25℃的條件下, 比重為1.010和1.012的海水并不能使得赤點石斑的精子發生激活; 當海水比重升高到1.014時, 精子被激活, 其活力為(47.50±10.84)%; 隨著海水比重的進一步增加, 精子活力迅速提高; 海水比重升至1.018時, 精子活力最高, 為(82.50±4.18)%, 相對于比重為1.016(活力為(80.00±3.16)%,P=0.433)和1.020(活力為(78.33±4.08)%,P=0.194)的處理組無顯著性差異, 但顯著高于其余的處理組(P＜0.05); 之后, 隨著海水比重的繼續增加, 精子的活力逐漸降低(圖1)。可見, 比重為1.018的海水對于赤點石斑魚精子具有最佳的激活效果, 相應的鹽度為25.7‰, 滲透壓為821 mOsm/kg。因此, 本研究其他部分所獲取的精子活力數據均為使用比重為1.018的海水激活所得。

2.3 冷凍速率(高度)的篩選

通過控制精子樣品距離液氮面的高度, 來改變冷凍過程的降溫速率。發現經1、3、7和15 cm等4個不同高度的處理, 所得凍精的活力分別為: (43.33±4.08)%、(48.33±2.58)%、(65.83±3.76)%和(55.83±3.76)%, 明顯低于鮮精85%的活力(P＜0.0001,極具顯著性)。不同高度(冷凍速率)之間均表現出顯著性差異(P＜0.05), 其中以7 cm高度凍存的精子具有最好的凍后活力, 顯著高于其他各組(P＜0.0001)(圖2)。因此, 在后續的實驗中, 選擇距離液氮面7 cm的高度對赤點石斑魚精子進行冷凍。

表1 赤點石斑魚基本參數 Tab. 1 Basic parameters of red spotted groupers

表2 不同比重海水的鹽度及其滲透壓(水溫25℃) Tab. 2 The corresponding salinity and osmolality of seawater with various specific gravity (water temperature was 25℃)

圖1 不同比重海水對赤點石斑魚精子的激活效果 Fig. 1 Activation effect of the seawater with different gravity on red spot grouper sperm

圖2 冷卻速率對凍精活力的影響 Fig. 2 Effect of cooling rate on post-thaw sperm motility

2.4 冷凍保存液的比較

采用不同的冷凍保存液A、B、C來凍存赤點石斑魚的精子, 各處理組的凍精活力均顯著低于鮮精活力(鮮精活力85%,P<0.0001)。其中, 冷凍保存液B的凍精效果最好, 活力為(67.92±3.96)%, 顯著高于凍存液A(凍精活力(59.17±6.34)%,P=0.001)以及凍存液C(凍精活力(62.92±6.89)%,P=0.045), 凍存液A和C之間無顯著性差異(P=0.127)(圖3)。

圖3 凍存液對凍精活力的影響 Fig. 3 Effect of cryopreservation solutions on post-thaw sperm motility

2.5 受精實驗

比較通過優化的凍存方案(凍存液B, 7 cm)獲得凍精與鮮精的受精效果, 發現在控制精卵比約為 200 000: 1的條件下, 均可獲得較好的受精率。其中, 鮮精受精率為(87.42±4.63)%, 凍精的受精率則為(74.55±4.31)%, 二者間的差異具有顯著性(P=0.017) (圖4)。

圖4 受精實驗 Fig. 4 Fertilization experiment

2.6 赤點石斑精子的短期保存

總體來看, 赤點石斑魚的精子在4℃的環境中, 其活力隨著保存時間的延長, 逐漸降低, 降低速率先慢后快, 約兩周后降低為0。總體上, 通過Hank’s稀釋的精子保存效果與未稀釋的精子基本一致, 在各個時間點, 兩者之間無顯著性差異(圖5)。

圖5 赤點石斑魚精子的短期保存 Fig. 5 Short-term storage of red spot grouper sperm

3 討論

3.1 海水比重對于精子激活的影響

除少數卵胎生的魚類, 如胎鳉科(Poeciliidae)的劍尾魚(Xiphophorus hellerii)、孔雀魚(Poecilia reticulata)等, 絕大多數的卵生魚類其精子排出體外之前均處于靜止狀態, 只有在受精時, 被排入水體中受到相應的刺激, 才轉變成快速運動的精子, 這一過程稱之為精子的激活。溶液滲透壓對于魚類精子的激活至關重要[8], 淡水魚類的精子對于低滲敏感, 因此, 滲透壓較低的淡水可激活其精子; 海水魚類精子則相反, 對高滲敏感, 在滲透壓較高的海水中才被激活[9]。海水滲透壓與其鹽度密切相關, 鹽度越高則滲透壓越高, 而在溫度一定的情況下, 海水的比重可隨著鹽度的增高而增高, 二者成正比關系, 并且海水比重也是最方便測量得到的數據。因此, 研究海水比重對精子激活的影響, 其本質是研究不同滲透壓的海水對精子的激活效果。實驗結果表明, 在25℃的條件下, 能引起赤點石斑魚精子激活的最低海水比重介于1.012與1.014之間, 相應的滲透壓則是571～655 mOsm/kg, 高于赤點石斑的精漿滲透壓353 mOsm/kg[7]。比重為1.018的海水表現出最佳的激活效果, 雖然相對于比重為1.016以及1.020的海水激活效果無顯著差異, 但顯著高于其余比重的海水, 與之對應的滲透壓為821 mOsm/kg。隨著海水比重進一步的增高, 其激活的效果逐漸呈現下降的趨勢, 這意味著雖然高滲有利于赤點石斑精子的激活, 但過高的滲透壓反而會對降低精子激活的效果。值得注意的是, 實驗期間的海水比重穩定在1.022～1.023, 介于此比重范圍的海水卻并不能對赤點石斑精子起到最佳的激活效果; 而比重為1.018的海水雖具備最佳的激活效果, 但是赤點石斑魚受精卵在該比重的海水中卻不能很好的上浮。從充分利用精子的角度考慮, 之后的受精實驗部分, 首先使用少量比重為1.018的海水予以激活, 再加入比重較大的海水, 提高水體比重, 使受精卵上浮。

3.2 赤點石斑魚精子的超低溫冷凍

超低溫冷凍保存技術是長期保存精子等生物材質的有效手段。在液氮-196℃的低溫狀態下, 精子的新陳代謝幾乎完全停止, 可歷經數年仍保持凍存時的生理生化狀態, 只有將其解凍, 才可恢復精子的生理功能[10]。針對魚類精子超低溫冷凍研究多通過簡易冷凍裝置進行, 以泡沫箱最為常見。通過調節泡沫箱內精子樣品距離液氮面的高度, 來獲得最適宜該種精子冷凍的降溫速率。

本實驗中, 首先通過借鑒Cabrita等[11]凍存灰石斑魚(Epinephelus marginatus)的方案, 使用含10%DMSO、1%NaCl、10 g/L BSA的凍存液, 來摸索簡易冷凍裝置中最適合凍存赤 點石斑精子的降溫速率。實驗中, 設計了4個不同的高度, 1、3、7、15 cm,代表了4個依次降低的降溫速率。其中以7 cm高度最適宜赤點石斑精子的冷凍, 表明赤點石斑的精子適合以一個適中的降溫速率進行冷凍。

在確立降溫速率之后, 進一步對凍存液進行了篩選。由于生理鹽水與1%的NaCl差別很小、且生理鹽水具有低價易得、無菌無污染等特點, 實驗中以生理鹽水為基礎溶液設計了凍存液 A(生理鹽水+10%DMSO), 并添加非滲透型抗凍劑海藻糖(凍存液B,在凍存液A的基礎上加入30 g/L的海藻糖)以評價海藻糖是否可提高赤點石斑魚精子的凍存效果。同時將Cabrita等[11]用于灰石斑魚精子冷凍的凍存液(凍存液C)作為對比。結果表明生理鹽水完全可以代替1%的NaCl溶液來作為凍存液的基礎溶液。添加了BSA的凍存液C相比于成份簡單的凍存液A, 并未表現出顯著的優勢。而含有海藻糖的凍存液B, 其凍存效果顯著高于其他兩種凍存液。也說明了海藻糖對于赤點石斑魚精子凍存的積極作用。此外, 從價格和耐儲存的角度考慮, 海藻糖也較BSA更具優勢。

受精率則是評價凍存精子的質量更為敏感的指標。有研究指出[7], 精卵比低于200 000: 1時, 受精率將會明顯下降。因此, 實驗中控制了精子卵子的比例接近該比例, 從而讓受精率更為準確地反應凍精的質量。從結果可知, 經優化方案凍存的赤點石斑魚精子受精率為(74.55±4.31)%, 低于相應的鮮精受精率(87.42±4.63)%,P=0.017, 具有顯著性。說明優化后的凍存方案, 在活力降低的同時, 其受精能力也一定程度的下降, 但仍具有較高的應用價值。

石斑魚具有雌雄同體、雌性先熟的特點, 很難獲得足夠的雄魚,所以對石斑精子進行凍存, 才更有價值。通過凍存, 增加雄魚精子的儲備, 有利于石斑魚人工繁殖規模的擴大, 亦使得成熟季節不同的異種石斑魚之間的雜交成為可能, 如Kiriyakit等[12]利用冷凍的龍膽石斑魚(Epinephelus lanceolatus)的精子與斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)雜交, 并成功培育出雜交魚苗。從瀕危物種保護和海洋漁業資源可持續利用的角度來看, 也極具意義。

3.3 赤點石斑魚精子的短期保存

赤點石斑魚精子經海水激活后可持續運動長達半小時之久[7], 同為海水魚類的黃姑魚(Nibea albiflora), 其精子激活后的運動時間不超過10 min[13]。若不將之激活, 而是保存在4℃的環境之中, 可存活兩周左右, 而黃姑魚的精子僅能存活3 d[14]。未作稀釋處理的鮮精在短期保存的初期, 活力下降很慢, 至第四天精子活力由最初的85%降至75%～80%, 至第八天仍具有65%～70%的活力, 之后, 隨著保存時間的延長, 精子活力迅速降低, 至第十八天活力均降低為0。通過Hank’s平衡溶液稀釋, 并未取得明顯的保存效果提高。但考慮實際操作中極難完全避免尿液、糞便對精液帶來的污染, 因此, 仍有必要對輕微污染的鮮精及時添加Hank’s溶液以消除尿液、糞便帶來的滲透壓、pH等方面的影響。

實驗過程中發現, 取過精子的赤點石斑魚經過一周的休養, 可再次采集到精液。由于該魚自身生命力頑強, 可耐受多次的麻醉取精操作, 合理地將精子短期保存與重復取精相結合, 亦可有效地緩解精子不足的問題。同時, 由于赤點石斑魚精子在4℃條件下可保存較長的時間, 合理地短期保存使得在不運輸雄魚、不進行精子冷凍的情況下跨地域的精子傳遞成為可能。

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